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Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

我们前面已经学过了三张蛋白质浓度的测定方法,回想一下,还记得是哪三种吗?

对,就是紫外法,双缩脲法和lowry法,也就是Folin酚法。其中紫外法干扰多,双缩脲法灵敏度低,Folin酚法灵敏度很高但需要近1个小时的时间。
今天我们来学习第四种蛋白质浓度测定的方法,Bradford法,这是一种又灵敏又快速的方法。下面,我们一起来看看这种方法是怎么回事吧。

这个方法是Marion M. Bradford在1976年建立并发表的,其主要试剂是考马斯亮蓝G-250(Coomassie Brilliant Blue G-250)这样一种有机染料,所以此方法常被称为Bradford法或考马斯亮蓝法。

考马斯1.png

考马斯亮蓝G-250染料有三种形式:阴离子呈现蓝色,中性为绿色,而阳离子为红色,在酸性条件下,染料与蛋白质中的精氨酰、赖氨酰、组氨酰、酪氨酰、苯丙氨酰、色氨酰等残基通过静电相互作用和范德华力相结合,这种结合大约需要2min即可完成,结合后,染料从棕色变为蓝色,最大光吸收波长从465 nm转为595 nm,此颜色在1小时内保持稳定,不过在5-20min的范围内颜色稳定性最好。595 nm处吸光度的增加与结合染料的量成正比,也就与样品中的蛋白质的浓度成正比,所以我们可以通过测定595 nm处吸光度来计算溶液中蛋白质的浓度。

实验室配制考马斯亮蓝G-250染液很方便,只需要称取100 mg考马斯亮蓝G-250,溶于50 ml 95%乙醇中,这个过程可适当延长时间确保染料充分溶解。然后加入85%的磷酸100 ml,调至酸性环境,然后用纯水定容到1 L,考马斯亮蓝染液配好后一定要用滤纸过滤去除不溶的颗粒,避免对测定产生影响。

设计标准曲线时,可以使用0.1 mg/ml的标准蛋白质溶液,配制1 ml的0~0.1 mg/ml的一系列标准蛋白,并将待测样制作3个以上1 ml的平行样,按照1:5的比例与考马斯亮蓝G-250染液发生反应,在5-20 min内测定595 nm的吸光度A值。

考马斯2.png

或者使用1 mg/ml的标准蛋白质溶液,配制0.1 ml的0~1 mg/ml的一系列标准蛋白,并将待测样制作3个以上0.1 ml的平行样,按照1:50的比例与考马斯亮蓝G-250染液发生反应,在5-20 min内测定595 nm的吸光度A值。

考马斯3.png

Bradford法相比其他方法具有以下优点:

第一,其操作非常便捷,只需加入一种试剂,在5-20min内完成测试即可;
第二,此方法灵敏度高于我们以前学过的其他方法,最低可检测到1
μg的蛋白质;
第三,这种方法的干扰物质较少,NaCl、KCl、MgCl2、乙醇、硫酸铵等试剂均对测定没有影响。

不过,Bradford法也并非十全十美,
首先,碱性物质、去垢剂、Tris和EDTA等试剂对测定有一定影响,需要用对照扣除;
其次,不同种类的蛋白质,所含显色氨基酸不同,其吸光度也有所差异。

比如牛血清白蛋白(BSA)的吸光度值几乎相当于牛丙种球蛋白(IgG)的两倍,此方法一般推荐采用IgG、溶菌酶或卵清蛋白作为标准品,因为这几种蛋白质中所含显色氨基酸的量和大多数蛋白质比较接近,而BSA则高于一般蛋白质。

考马斯4.png

最后,因为考马斯亮蓝G-250染料本身两种颜色的光谱有一定重叠,与蛋白质结合时会引起背景颜色光吸收的变化,所以当蛋白质浓度较高的时候标准曲线会稍有弯曲,但弯曲的程度很轻,不影响测定。

 

 


下一节:Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

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第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

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-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

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--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

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-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

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--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

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--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

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-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

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-第四章 酶活力的测定 作业

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-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

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--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

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--拟南芥叶片基因组DNA提取

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--紫外分光光度法测定核酸

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

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--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

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--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法笔记与讨论

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