当前课程知识点:基础生物化学实验 >  第五章 物质的分离纯化 >  第二节 核酸的提取和检测 >  质粒DNA的提取制备

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质粒DNA的提取制备资料文件与下载

质粒DNA的提取制备

质粒是独立于染色体之外的能够自主复制的遗传成分。在自然界,无论是真核细胞还是原核细胞,甚至真菌的线粒体中都发现了质粒。在细菌中,绝大多数的质粒是环形双链DNA分子,如图所示。自上世纪70年代后,世界各地的实验室在天然质粒的基础上,成功地发展出具有各种不同功能的质粒,用于重组DNA的研究。质粒的提取制备是许多生物学研究的基础。这里我将介绍SDS碱裂解法小量制备大肠杆菌质粒DNA。

无论是大肠杆菌质粒,还是染色体,其化学本质都是DNA,那如何避免提取质粒DNA时,有染色体DNA的污染,以及一些蛋白质等杂质的污染呢?这是我们提取制备质粒DNA时,一定需要考虑的问题。下面是大肠杆菌质粒DNA制备的三个主要过程。

Ø  培养细菌,通过细菌增殖获得大量的质粒。

Ø  收集细菌培养液,裂解细胞

Ø  分离纯化质粒

首先,需要挑选单个细菌菌落,接种于装有35mL培养液的试管中,37℃,摇床上培养过夜。获得细菌培养液。

将获得的细菌培养液倒入离心管中, 6000rpm 室温离心5min,将上清液倒入废液缸中。之后再次6000 rpm离心1 min,将离心管壁上的液体离心下去,用移液器将离心后残留的细菌培养液吸干净,这步操作非常重要

加100uL预冷的 裂解液I 重新悬浮沉淀的细菌细胞; 振荡器上剧烈振荡,以充分悬浮沉淀,如图所示。

之后,在上述离心管中加入新鲜配置裂解液II 200uL,盖紧盖子,颠倒离心管5次。如视频所示。SDS和NaOH都有助于破碎细胞,而且不仅造成染色体和质粒DNA变性,也能够致使蛋白质变性。

注意:如果这步操作过于剧烈,将导致制备的质粒DNA中可能有细菌染色体DNA污染。

在上述离心管中再加入150uL裂解液III,盖紧盖子,颠倒离心管5次,与加裂解液II操作相同。加裂解液III之前、之后、颠倒5次后。然后,冰浴5min。这步操作的结果是染色体DNA无法复性,而质粒DNA复性。

冰浴后,14000rpm,4℃ ,离心8min。复性的质粒DNA进入上清液,而没有复性的染色体DNA以及蛋白质留在沉淀中。将上清液转移到另外一个新离心管中,加2倍体积的乙醇沉淀DNA,操作如视频。;之后室温静置2min。

将离心管置入离心机中,12000rpm 4℃ 离心5min;弃上清液,留沉淀,再用70%乙醇漂洗沉淀,弃去乙醇,之后用移液器将多余的乙醇吸掉,并用滤纸条吸掉残存的液体,你可以看到滤纸条上吸取了一定量的乙醇。 这步操作也很重要

. 然后,将离心管倒扣,室温晾干10min;加入一定体积的pH8.0 的TE缓冲液,在使用TE时,需要现加入RNase A酶,轻弹离心管管底使DNA溶解,

将离心管65℃水浴15min,以水解质粒样品中可能存在的RNA。为了检验制备质粒的质量,可以进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条带,靠上面的条带是开环环形DNA,靠下面的是超螺旋DNA。可以看出中没有染色体DNA污染的条带,也没有RNA的污染,说明质粒提取成功。


下一节:拟南芥叶片基因组DNA提取

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基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

--离子交换层析

--亲和层析

--亲和层析

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

质粒DNA的提取制备笔记与讨论

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