当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第二节 核酸的提取和检测 > 质粒DNA的提取制备
质粒是独立于染色体之外的能够自主复制的遗传成分。在自然界,无论是真核细胞还是原核细胞,甚至真菌的线粒体中都发现了质粒。在细菌中,绝大多数的质粒是环形双链DNA分子,如图所示。自上世纪70年代后,世界各地的实验室在天然质粒的基础上,成功地发展出具有各种不同功能的质粒,用于重组DNA的研究。质粒的提取制备是许多生物学研究的基础。这里我将介绍SDS碱裂解法小量制备大肠杆菌质粒DNA。
无论是大肠杆菌质粒,还是染色体,其化学本质都是DNA,那如何避免提取质粒DNA时,有染色体DNA的污染,以及一些蛋白质等杂质的污染呢?这是我们提取制备质粒DNA时,一定需要考虑的问题。下面是大肠杆菌质粒DNA制备的三个主要过程。
Ø 培养细菌,通过细菌增殖获得大量的质粒。
Ø 收集细菌培养液,裂解细胞
Ø 分离纯化质粒
首先,需要挑选单个细菌菌落,接种于装有3~5mL培养液的试管中,37℃,摇床上培养过夜。获得细菌培养液。
将获得的细菌培养液倒入离心管中, 6000rpm 室温离心5min,将上清液倒入废液缸中。之后再次6000 rpm离心1 min,将离心管壁上的液体离心下去,用移液器将离心后残留的细菌培养液吸干净,这步操作非常重要。
加100uL预冷的 裂解液I 重新悬浮沉淀的细菌细胞; 振荡器上剧烈振荡,以充分悬浮沉淀,如图所示。
之后,在上述离心管中加入新鲜配置的裂解液II 200uL,盖紧盖子,颠倒离心管5次。如视频所示。SDS和NaOH都有助于破碎细胞,而且不仅造成染色体和质粒DNA变性,也能够致使蛋白质变性。
注意:如果这步操作过于剧烈,将导致制备的质粒DNA中可能有细菌染色体DNA污染。
在上述离心管中再加入150uL裂解液III,盖紧盖子,颠倒离心管5次,与加裂解液II操作相同。加裂解液III之前、之后、颠倒5次后。然后,冰浴5min。这步操作的结果是染色体DNA无法复性,而质粒DNA复性。
冰浴后,14000rpm,4℃ ,离心8min。复性的质粒DNA进入上清液,而没有复性的染色体DNA以及蛋白质留在沉淀中。将上清液转移到另外一个新离心管中,加2倍体积的乙醇沉淀DNA,操作如视频。;之后室温静置2min。
将离心管置入离心机中,12000rpm 4℃ 离心5min;弃上清液,留沉淀,再用70%乙醇漂洗沉淀,弃去乙醇,之后用移液器将多余的乙醇吸掉,并用滤纸条吸掉残存的液体,你可以看到滤纸条上吸取了一定量的乙醇。 这步操作也很重要。
. 然后,将离心管倒扣,室温晾干10min;加入一定体积的pH8.0 的TE缓冲液,在使用TE时,需要现加入RNase A酶,轻弹离心管管底使DNA溶解,
将离心管65℃水浴15min,以水解质粒样品中可能存在的RNA。为了检验制备质粒的质量,可以进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条带,靠上面的条带是开环环形DNA,靠下面的是超螺旋DNA。可以看出中没有染色体DNA污染的条带,也没有RNA的污染,说明质粒提取成功。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
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-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
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-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
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--移液器的日常校准
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-第二章 移液器的使用 作业
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--分光光度法的原理
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-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
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-第二章 离心机的使用 作业
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-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
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-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
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--盐析操作注意事项
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--离子交换层析
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--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试