当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第四章 酶活力的测定 > 第三节 酶米氏常数的测定 > 菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)
我们已经学习过了菠萝蛋白酶活力的测定,相信同学们已经掌握了酶学实验的设计原理和思路以及酶活力和比活力的计算方法,同学们能够根据实验原理和实验指导独立完成菠萝蛋白酶米氏常数的测定实验和结果计算吗?
菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验,操作与酶活力的测定类似,不过在设计上,因为要让一定量的酶与不同浓度的底物发生反应,所以需要用缓冲液和酪蛋白先配制一系列不同浓度的底物溶液,注意底物浓度的设计,要使其倒数也是整数。
配制好的一系列浓度底物,预先在水浴中温热到37℃,同时把酶液也温浴到37℃,把定量的酶液加入到不同浓度的底物中,注意每管之间间隔固定时间,然后开始计时,10 min后依然每管间隔固定时间加入终止试剂三氯乙酸,确保每管的反应时间都是准确的10 min。
米氏常数的测定实验中同样需要设计对照管,理论上来说,应该针对每一支酶反应管设计对照管,并同步反应,扣除掉每管中非酶促反应时间生成的产物。
针对本实验,我们在前期预实验时发现每支对照管中产物生成量都非常少,所以将对照简化为1管,最后统一扣除。
酶反应结束,离心去除蛋白质,然后将上清与酪氨酸标准曲线一起测定
计算每管中生成酪氨酸的浓度,在此基础上计算各管中酪氨酸生成的速度,即反应速度v,以1/[S]和1/v为横纵坐标作图,计算米氏常数KM和Vmax。
我们在淀粉酶的米氏常数测定一节中已经给大家分析过反应速度和底物浓度的计算方法,主要是确定反应体系的体积,请同学们自己根据我们提供的数据练习计算一下KM和Vmax,在下一节中我们一起来讨论计算结果吧。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试