当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第二节 核酸的提取和检测 > 质粒DNA的提取制备
质粒是独立于染色体之外的
能够自主复制的遗传成分
在自然界
无论是真核细胞还是原核细胞
甚至真菌的线粒体中都发现了质粒
在细菌中绝大多数的质粒是环形
双链DNA分子
如图所示
自上世纪70年代后
世界各地的实验室在
天然质粒的基础上
成功的发展出具有各种
不同功能的质粒
用于重组DNA的研究
质粒的提取制备是许多
生物学研究的基础
这里我将介绍SDS碱裂解法
小量制备
大肠杆菌
质粒DNA
无论是大肠杆菌 质粒还是染色体
其化学本质都是DNA
如何避免提取质粒DNA时
有染色体DNA的污染
以及一些蛋白质等杂质的污染
这是我们提取制备质粒DNA
时一定需要考虑的问题
下面是大肠杆菌质粒DNA
制备的三个主要过程
第一培养细菌
通过细菌增殖获得大量质粒
第二收集细菌培养液裂解细胞
第三 分离纯化质粒
首先需要挑取单个细菌菌落
接种于装有3~5mL
培养液的试管中
37℃摇床上培养过夜
获得细菌培养液
如图片所示
将获得的细菌培养液倒入离心管中
6000rpm室温离心5分钟
将上清液倒入废液缸中
之后再次6000rpm
离心1分钟
将离心管壁上的液体离心下去
用移液器将离心管残留
的细菌培养液吸干净
这步操作非常重要
之后加100uL遇冷的裂解液I
重新悬浮沉淀的细菌细胞
振荡器上剧烈振荡
已充分悬浮沉淀
如图所示
之后在上述离心管中加入
新鲜配制的裂解液II
200uL
盖紧盖子
颠倒离心管5次
如视频所示
然后冰浴5分钟
SDS
和氢氧化钠都有助于破碎细胞
而且不仅造成染色体
和质粒DNA变性
也能够致使蛋白质变性
注意如果这步操作过于激烈
将导致制备的质粒DNA中可能
有细菌染色体DNA污染
在上述离心管中
再加入150uL裂解液III
盖紧盖子
颠倒离心管5次
与加裂解液II操作相同
具体实验现象如图片所示
诸如加裂解液III之前之后颠倒5次后
然后冰浴5分钟
这步操作的结果是染色体
DNA无法复性
而质粒DNA复性
冰浴后14,000rpm
4℃
离心8分钟
复性的质粒DNA进入上清液
而没有复性的染色体
DNA以及蛋白质留在沉淀中
将上清液转入到另外
一个新的离心管中
加两倍体积的乙醇沉淀DNA
操作如视频
之后室温静置2分钟
将离心管至于离心机中12,000rpm
4℃
离心5分钟
弃上清留沉淀如图片所示
再用70%的乙醇漂洗沉淀
弃去乙醇之后
用移液器将多余的乙醇吸掉
并用滤纸条吸掉残存的液体
如图片所示
你可以看到滤纸条上吸取
了一定量的乙醇
这步操作也很重要
然后将离心管倒扣室温
晾干10分钟
加入一定体积的pH8.0
的TE 缓冲液
在使用TE时
需要现加入RNase A 酶
轻弹离心管管底
使DNA溶解
如视频所示
将离心管65℃ 水浴15分钟
以水解质粒样品中可能存在的RNA
为了检验制备质粒的质量
可以进行琼脂糖凝胶电泳
图片显示了两条带
靠上面的条带是开环环形DNA
靠下面的是超螺旋DNA
可以看出图片中没有染色体
DNA污染的条带
也没有RNA的污染
说明质粒提取是成功的
让我们一起回顾质粒提取的主要流程
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试