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菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)
一、 实验试剂
1. 0.1 M磷酸缓冲液(PBS,pH 7)
2. 0.1 mg/mL酪氨酸:称取100 mg酪氨酸粉末溶解在纯水中,定容到1 L。
3. 0.55 mol/L Na2CO3:称取58.3 g Na2CO3溶解在纯水中,定容到1 L。
4. Folin酚试剂(Sigma,F9252):所购买Folin酚试剂为2N,使用前用纯水稀释1倍,装入棕色玻璃试剂瓶使用。
5. 10 mg/ml 酪蛋白:称取1 g酪蛋白粉末,加入少量0.1 M NaOH润湿,再加入0.1M pH 7磷酸缓冲液约80ml,70℃水浴加热搅拌至彻底溶解,然后定容到100ml。
6. 15%三氯乙酸(TCA):称取15 g三氯乙酸溶解在纯水中,定容到100 ml。
7. 茎菠萝蛋白酶液。
二、 实验器材
移液器、可见分光光度计(含比色杯)、恒温水浴锅、台式高速离心机
三、 实验步骤
1. 菠萝蛋白酶活力测定
按下表在试管中配制一系列酪蛋白浓度溶液,37℃保温2 min,空白管中加入1 ml三氯乙酸,各管中依次加入预热的菠萝蛋白酶溶液1 ml,37℃保温10 min后在各酶反应管中依次加入三氯乙酸1 ml终止反应,注意保持每支试管加入酶液和三氯乙酸的间隔时间一致,保证每支试管中反应时间严格控制在10 min。
反应结束后从每支酶反应管中取出1.5 mL溶液加入2 mL小离心管,14000 rpm离心5 min,小心吸取0.5 ml上清液,分别转移到干净的刻度试管中,与标准曲线一起测定酪氨酸浓度。
2. 酪氨酸(Tyr)标准曲线绘制
按下表配制标准曲线各管,并准备好酶反应液管,所有试管中依次加入4 mL Na2CO3,然后再依次加入0.5 mL Folin酚试剂,立即颠倒混匀,室温放置30 min后,680nm处测定吸光度值。
3. 绘制酪氨酸标准曲线,计算对照和各酶反应管的反应速度v,以1/[S]为横坐标,以1/v为纵坐标绘制双倒数作图曲线,计算此菠萝蛋白酶的米氏常数KM和Vmax。
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-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
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--移液器的日常校准
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-第二章 移液器的使用 作业
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--分光光度法的原理
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-第二章 分光光度计的使用 作业
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--离心机的操作要点
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-第二章 离心机的使用 作业
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