当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第六章 利用电泳对生物大分子进行检测 > 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 > SDS-PAGE电泳凝胶的染色
同学们好
上节课我们学习了SDS-PAGE
的原理以及操作方法
电泳结束后蛋白质
条带肉眼是看不到的
需要通过染色的方法才能显现出来
从而检测它们的大小
纯度和含量
蛋白质的染色液和染色方法都有哪些
这节课我们就来学习
SDS-PAGE电泳凝胶的染色
电泳后有不同的染色方法
所用染色液的原理和灵敏度各不相同
实验室常用的蛋白质染色方法有
考马斯亮蓝染色法
以及银染法
我们称之为传统染色法
在传统染色法基础上也产生
了一些改进的快速染色法
使染色更为方便快速
蛋白质也可以采用荧光染色的方法
这种方法在蛋白质
组学研究中使用较多
考马斯亮蓝
染色法是SDS-PAGE电泳后
蛋白质染色最常用的方法
使用的染料是
考马斯亮蓝R-250
考马斯亮蓝R-250
中文名称是三苯基甲烷
能渗入凝胶与蛋白质的
碱性基团非共价结合
使蛋白质条带呈现蓝色
染料的结合量和蛋白质的量成正比
因此可以测定蛋白质的含量
考马斯亮蓝
检测的灵敏度可达到10纳克
考马斯亮蓝
染色法需要染色液和脱色液
染色液对蛋白质条带进行固定和染色
染色液也会与凝胶以低亲和力结合
因此需要脱色液将凝胶
背景处的染料去除
使蛋白质条带能清晰显示出来
SDS-PAGE电泳结束后
取出凝胶切去溴酚蓝前沿和浓缩胶后
将凝胶放入染色液中
放置在摇床上染色30分钟以上
然后倒出染色液
染色液可以回收使用几次
凝胶用清水漂洗一次后放入
装有脱色液的容器中
摇床震荡脱色到蛋白质条带清晰
的时候就可以停止脱色了
脱色期间需要更换三至四次脱色液
实验室常用的另一种传统
染色法是银染法
银染的方法很多
染色机制还不是很明确
可能是由染色液中的银离子
与氨基酸侧链基团结合
随后蛋白质条带上结合的银
离子被还原为金属银沉积
在蛋白质条带上显色
银染法的灵敏度比
考马斯亮蓝
染色法高100倍以上
可检测低至0.1纳克的蛋白质条带
与考马斯亮蓝
染色法相比
银染法操作步骤多
染色的时间比较长
因为银染具有不同的染色方法
这里我们就不详细介绍染色的过程了
感兴趣的同学可以在相关的实验
指南上查找到银染的方法
选择省时高效的银染方法
为了提高染色的效率和效果
研究者也在不断对染色方法进行改进
通过改变染色液的成分
提高染色的灵敏度
或者是在染色和脱色的过程中加热
来缩短染色和脱色的时间
这里提供的就是一份通过微波炉加热
染色和脱色过程的方案
可在半小时左右完成染色和脱色
与传统染色法数小时相比
大大缩短了染色的时间
现在各个公司也提供一些改良的
考马斯亮蓝
快速染色的试剂
同学们也可以选择使用
蛋白质染色还可以采用荧光染色法
在蛋白质组学研究中应用比较多
荧光染料种类很多
不同染料原理及操作有所不同
它综合了考染法和银染法的优点
灵敏度与银染相当
可检测低至0.25纳克或
1纳克左右的蛋白质条带
但是操作流程比银染法简单
与考染和银染一样
荧光染色通常在电泳后进行
需要固定和脱色凝胶用成像
系统进行观察和拍照
通过本节课的学习
我们了解了SDS-PAGE
银胶染色的传统方法
包括考染法和银染法
以及改进的快速染色法和荧光染色法
同学们可以根据实验
的要求和实验条件
选择经济高效的染色方法
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
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-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
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-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
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-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
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-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
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-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
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--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试