当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第三节 其他物质的测定 > 核黄素荧光光度定量测定法
核黄素
也叫维生素B2
是一种存在于食物中的维生素
鸡蛋 绿色蔬菜 牛奶 肉类蘑菇
杏仁中都有核黄素
核黄素是1920年被发现
在1933年被分离出来
并且在1935年就首次完成了合成
它被列入世界卫生组织的基本药物清单
是目前认为最有效和最安全的药物之一
核黄素在水和酒精的中性溶液
中为黄色有很强的荧光
这种荧光在强酸或者强碱中容易被破坏
从荧光光谱图我们可以看出
核黄素的激发光波长范围比较宽
一般定在460纳米左右
而发射光波长的范围在
510~550纳米处
一般我们检测时定在520纳米左右
利用核黄素在稀溶液中荧光强度
与核黄素的浓度成正比这一特性
可以进行核黄素的定量测定
我们一般用30mM的醋酸
溶液溶解核黄素标准品
配置成10微克每毫升的标准核黄素溶液
按照这个表格配置标准曲线
其中0号管中不含有核黄素
我们可以用它作为空白管
来调节仪器的零点
接下来我们使用棱光牌
F95S荧光分光光度计
来进行测定核黄素标准曲线
和未知浓度样品的光吸收
核黄素的激发光谱在460纳米左右
所以我们要先安装465纳米的激发光源
开机预热30分钟
调节波长到待测物的发射
波长520纳米处
在控制面板按一选择荧光值的档位
把标准曲线浓度最高的样品倒入比色杯
请检查杯壁没有污渍
因为荧光分光光度计的激发光和
发射光的光路成90度夹角
所以需要使用四面透光的比色杯
因此我们在拿取比色杯的时候
需要注意不要直接
手持光面儿
应该手持边棱或者是顶部
将样品放入比色池
关上样品池盖
按下归一键
面板的右上角显示1
这是灵敏度
再按一次归一键
右上角显示为2
这时样品荧光的强度在116左右
我们就可以采用这个灵敏度
进行所有样品的测定
取出样品管再放入空白管
盖上样品池的盖子
按“调零”键
将荧光值强度显示为0
接下来依次放入待测定的所有样品
并记录荧光强度的值
需要注意的是
荧光比色杯重复使用的时候
请务必先用去离子水彻底清洗多次
每次尽量去除掉残余的液体
然后再倒入待测样品进行润洗
润洗的操作同样是倒入少量液体
倾斜比色杯
使液体流经各个内壁
将润洗液倒掉
这样润洗2~3次就可以彻底
去除残余液体的影响
然后再加入待测液
放入样品池
盖上样品池盖
记录荧光强度值
测定结束后记得关机和彻底清洗比色杯
我们以标准曲线的核黄素浓度为横坐标
以荧光强度值为纵坐标
绘制标准曲线
根据标准曲线方程计算出待测物的浓度
需要注意的是
核黄素的荧光会被日光淬灭
所以操作的过程中请大家注意避光
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--移液器的日常校准
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