当前课程知识点:基础生物化学实验 >  第五章 物质的分离纯化 >  第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 >  盐析操作注意事项

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频课程列表

盐析操作注意事项资料文件与下载

盐析操作注意事项

进行盐析操作时,加入的中性盐有哪些呢?常见的有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾和氯化钠等等。

在分离纯化过程中,硫酸铵使用最为普遍。

原因在于,硫酸铵作为中性盐具有以下优点:溶解性高,温度系数小,如表格所示。即便是在0℃下,都可达到每升溶液中能够溶解697g固体硫酸铵;其次硫酸铵便宜,而且在条件适合时,使用硫酸铵沉淀蛋白还不会引起蛋白质变性,该方法能够有效维持蛋白质的活性;第三,硫酸铵是二价离子,同样浓度下比氯化钠离子强度更高,更容易导致蛋白质发生沉淀;因此在实验操作中,是大家普遍选择的中性盐。

由于氯化钠相对比较便宜,常用于工业化生产。

在使用硫酸铵时,通常有两种方法:加入饱和硫酸铵溶液或者直接加入固体硫酸铵。

那如何配置饱和硫酸铵溶液呢?

取固体硫酸铵(NH4)2SO4  800g,加去离子水1000 mL,不断搅拌条件下加热至50~60℃,保持30 min,趁热过滤,滤液在室温中过夜,有结晶析出,即达到100% 饱和度。

如果加入固体硫酸铵,可以直接查阅硫酸铵溶液饱和度计算表,简单计算固体硫酸铵的加入量。注意硫酸铵溶液饱和度计算表有0 ℃和25 ℃两种。查阅时一定要看清楚温度,根据自己的实验条件,依据合适的计算表进行计算。

下面请你计算,室温下固体硫酸铵的加入量。

如果现有100mL蛋白粗提液,我想得到50%饱和度的硫酸铵溶液,需要加入多少固定硫酸铵呢?

看表格,第三行,显示的是每100mL溶液加入固体硫酸铵的量,

第四行, 50饱和度那列的数字是31.3,表格中数字表示的是从不含硫酸铵的溶液到加入硫酸铵达到50%饱和度溶液时,需要加入固体硫酸铵的克数。

请注意65饱和度的数据是43g,

下面计算:如果现有185mL蛋白粗提液,我想得到65%饱和度的硫酸铵溶液,需要加入多少固体硫酸铵呢?如公式所示。

明白了这些计算后,让我们再看看下面的问题

如图所示:烧杯中有A、B、C三种蛋白质。假如 A蛋白是目标蛋白,在20%饱和度硫酸铵溶液中溶解性最小,而B和C分别在50%和80%饱和度硫酸铵溶液中溶解性最小,那如何获得A蛋白呢?

是不是直接加硫酸铵到20%饱和度,离心,弃去上清液,沉淀就是目标蛋白A呢?对, 就是如此获得目标蛋白A。

如果A蛋白不是目标蛋白,而B蛋白是呢?那如何获得B蛋白呢?

直接加硫酸铵到20%饱和度,离心,弃去杂蛋白沉淀。在上清液中再加入硫酸铵到50%饱和度,离心,沉淀中就有大量的目标蛋白B。

那么加入多少克固体硫酸铵才能将蛋白质溶液从20%饱和度调至50%饱和度硫酸铵溶液呢?

看计算表横行饱和度20那行,即第六行,竖列饱和度50那列,交叉处数值是19克,表示每100mL 20%饱和度硫酸铵溶液中加入19克固体硫酸铵即可达到50%饱和度。

那如何加入固体硫酸铵呢?在实际工作中,加入硫酸铵操作有以下注意事项:

第一,在搅拌条件下,少量,多次,缓慢加入

第二,硫酸铵加入完毕后,需要静置30min以上,离心分离上清液和沉淀。    

那为什么要如此操作呢?请考虑一下。

在搅拌条件下,缓慢加入,目的是避免快速加入造成溶液局部盐浓度过高,致使某些高饱和度硫酸铵溶液才能沉淀下来的蛋白质发生沉淀,影响分离效果。

硫酸铵加入完毕后,需要静置30min以上,离心分离上清液和沉淀,该步操作的目的是,让该饱和度下沉淀的蛋白质充分沉淀。

在现实生活中,常用到盐析方法。

例如,重组生长激素的分离纯化及其结构确定,这篇文献就涉及到盐析方法,如图所示在前期纯化获得的低渗溶液中,加入固体硫酸铵使溶液达到45%饱和度,搅拌均匀后,放置在2 8 ℃条件下,静置盐析2 小时8 000 × g 离心30 min,收集沉淀,经缓冲液溶解回收,8 000 × g 离心30 min,收集上清液,该溶液即为盐析沉淀回收溶液。这步沉淀是为了获得目标蛋白。之前我们也谈到过盐析去除杂蛋白的方式。这里不再举例。

以上是本视频的主要内容,下面我将对本部分内容进行小结

在这个视频中,我首先讲解了硫酸铵作为中性盐的优越性能;介绍了获得不同饱和度硫酸铵溶液,固体硫酸铵加入量的计算

最后指出了硫酸铵加入的注意事项。


下一节:蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频列表

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

--离子交换层析

--亲和层析

--亲和层析

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

盐析操作注意事项笔记与讨论

收藏文章
表情删除后不可恢复,是否删除
取消
确定
图片正在上传,请稍后...
  • 评分:
评论内容为空!
还没有评论,快来抢沙发吧!

也许你还感兴趣的课程:

© 柠檬大学-慕课导航 课程版权归原始院校所有,
本网站仅通过互联网进行慕课课程索引,不提供在线课程学习和视频,请同学们点击报名到课程提供网站进行学习。
欢迎学习『盐析操作注意事项慕课视频播放-基础生物化学实验-MOOC慕课视频教程-柠檬大学』