当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > 盐析操作注意事项
进行盐析操作时,加入的中性盐有哪些呢?常见的有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾和氯化钠等等。
在分离纯化过程中,硫酸铵使用最为普遍。
原因在于,硫酸铵作为中性盐具有以下优点:溶解性高,温度系数小,如表格所示。即便是在0℃下,都可达到每升溶液中能够溶解697g固体硫酸铵;其次硫酸铵便宜,而且在条件适合时,使用硫酸铵沉淀蛋白还不会引起蛋白质变性,该方法能够有效维持蛋白质的活性;第三,硫酸铵是二价离子,同样浓度下比氯化钠离子强度更高,更容易导致蛋白质发生沉淀;因此在实验操作中,是大家普遍选择的中性盐。
由于氯化钠相对比较便宜,常用于工业化生产。
在使用硫酸铵时,通常有两种方法:加入饱和硫酸铵溶液或者直接加入固体硫酸铵。
那如何配置饱和硫酸铵溶液呢?
取固体硫酸铵(NH4)2SO4 800g,加去离子水1000 mL,不断搅拌条件下加热至50~60℃,保持30 min,趁热过滤,滤液在室温中过夜,有结晶析出,即达到100% 饱和度。
如果加入固体硫酸铵,可以直接查阅硫酸铵溶液饱和度计算表,简单计算固体硫酸铵的加入量。注意硫酸铵溶液饱和度计算表有0 ℃和25 ℃两种。查阅时一定要看清楚温度,根据自己的实验条件,依据合适的计算表进行计算。
下面请你计算,室温下固体硫酸铵的加入量。
如果现有100mL蛋白粗提液,我想得到50%饱和度的硫酸铵溶液,需要加入多少固定硫酸铵呢?
看表格,第三行,显示的是每100mL溶液加入固体硫酸铵的量,
第四行, 50饱和度那列的数字是31.3,表格中数字表示的是从不含硫酸铵的溶液到加入硫酸铵达到50%饱和度溶液时,需要加入固体硫酸铵的克数。
请注意65饱和度的数据是43g,
下面计算:如果现有185mL蛋白粗提液,我想得到65%饱和度的硫酸铵溶液,需要加入多少固体硫酸铵呢?如公式所示。
明白了这些计算后,让我们再看看下面的问题
如图所示:烧杯中有A、B、C三种蛋白质。假如 A蛋白是目标蛋白,在20%饱和度硫酸铵溶液中溶解性最小,而B和C分别在50%和80%饱和度硫酸铵溶液中溶解性最小,那如何获得A蛋白呢?
是不是直接加硫酸铵到20%饱和度,离心,弃去上清液,沉淀就是目标蛋白A呢?对, 就是如此获得目标蛋白A。
如果A蛋白不是目标蛋白,而B蛋白是呢?那如何获得B蛋白呢?
直接加硫酸铵到20%饱和度,离心,弃去杂蛋白沉淀。在上清液中再加入硫酸铵到50%饱和度,离心,沉淀中就有大量的目标蛋白B。
那么加入多少克固体硫酸铵才能将蛋白质溶液从20%饱和度调至50%饱和度硫酸铵溶液呢?
看计算表横行饱和度20那行,即第六行,竖列饱和度50那列,交叉处数值是19克,表示每100mL 20%饱和度硫酸铵溶液中加入19克固体硫酸铵即可达到50%饱和度。
那如何加入固体硫酸铵呢?在实际工作中,加入硫酸铵操作有以下注意事项:
第一,在搅拌条件下,少量,多次,缓慢加入
第二,硫酸铵加入完毕后,需要静置30min以上,离心分离上清液和沉淀。
那为什么要如此操作呢?请考虑一下。
在搅拌条件下,缓慢加入,目的是避免快速加入造成溶液局部盐浓度过高,致使某些高饱和度硫酸铵溶液才能沉淀下来的蛋白质发生沉淀,影响分离效果。
硫酸铵加入完毕后,需要静置30min以上,离心分离上清液和沉淀,该步操作的目的是,让该饱和度下沉淀的蛋白质充分沉淀。
在现实生活中,常用到盐析方法。
例如,重组人生长激素的分离纯化及其结构确定,这篇文献就涉及到盐析方法,如图所示在前期纯化获得的低渗溶液中,加入固体硫酸铵使溶液达到45%饱和度,搅拌均匀后,放置在2 ~ 8 ℃条件下,静置盐析2 小时;8 000 × g 离心30 min,收集沉淀,经缓冲液溶解回收,8 000 × g 再离心30 min,收集上清液,该溶液即为盐析沉淀回收溶液。这步沉淀是为了获得目标蛋白。之前我们也谈到过盐析去除杂蛋白的方式。这里不再举例。
以上是本视频的主要内容,下面我将对本部分内容进行小结
在这个视频中,我首先讲解了硫酸铵作为中性盐的优越性能;介绍了获得不同饱和度硫酸铵溶液,固体硫酸铵加入量的计算
最后指出了硫酸铵加入的注意事项。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
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-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
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-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
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--移液器的日常校准
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-第二章 移液器的使用 作业
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-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
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-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
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-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
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-第二章 离心机的使用 作业
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-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
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-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
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-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
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--盐析操作注意事项
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--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试