当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第一节 蛋白质的定量测定 > 双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法
我们已经学过了紫外法测定蛋白质浓度
但是我们也知道在紫外区
会有核酸等物质的干扰
导致测定结果不准确
今天我们来学习另一种测定蛋白质的方法
双缩脲法
这也是一个非常经典的
蛋白质定量测定方法
什么是双缩脲呢
两分子尿素在180度的条件下
速和释放出一分子的氨
形成化合物就叫做双缩脲
双缩脲这种物质在碱性溶液
中可以和铜离子发生反应
生成紫红色的络合物
大家看双缩脲分子的结构式
其中的酰胺基部分是不是和
蛋白质的肽键很相似呢
所以含有肽键的肽和蛋白质
也同样可以在碱性条件下
与铜离子发生反应
生成紫红色的络合物
络合物的颜色深浅和蛋白质的浓度成正比
因为是和肽键发生的反应
所以颜色的深浅与蛋白质的氨基酸
组成和蛋白质的分子量没有关系
不同种类的蛋白质所生成产物的颜色接近
这一点是和紫外法不同的
所生成的紫外络合物
在紫外区和可见区都有光吸收
而且在260~280
纳米处有最大光吸收
但是因为这个区域的干扰因素
和空白管的光吸收都比较强
所以实际测定中
我们常用的是540纳米处进行测定
这一点我们在前面分光光度法测定
物质浓度的实验设计一节中
已经讨论过
此方法测定蛋白质的浓度
在1~10毫克每毫升
它会受到Tris、蔗糖和甘油等物质的影响
双缩脲法的具体操作是取9支试管
按照实验指导中设计的管号
依次做好标记
按照实验指导的标准曲线
先依次加入设计体积的水
然后再依次加入设计体积
的标准蛋白质溶液
更换吸头
在三只样品管中各加入一毫升待测溶液
然后统一加入4毫升双缩脲试剂
混匀放置30分钟
请注意
对于所有需要发生化学反应
进行测定的定量方法来说
标准曲线和待测样品需要在
短时间内依次加入反应试剂
不能分别完成标准曲线和待测样品的测定
将因周围环境和实际条件
的因素带来较大误差
加入双缩脲试剂的反应
期间打开分光光度计电源预热
调节波长至540纳米
反应结束
先调节分光光度计的透光率0%
以标准曲线第一管为空白管
按照仪器的操作流程
调节仪器透光率100%
依次测定标准曲线
各管
更换溶液
请按我们前面所讲的方法
正确润洗比色杯
测定期间请保持空白管
一直在分光光度计内
每次打开样品池盖更换
样品后都要检查
空白管的透光率100%
测定完标准曲线后
继续将空白管保留在样品池内
其余比色杯用去离子水彻底清洗
然后依次用各样品管润洗后
测定样品管的吸光度值
正确记录所有的实验数据
实验结束后
关闭分光光度计
取出所有比色杯
彻底洗涤后倒置晾干
分析数据计算结果
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