当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第一节 蛋白质的定量测定 > 紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算
在学过了紫外法测定蛋白质浓度的实验原理和操作以后,我们一起来试试如何计算待测液中的蛋白质浓度吧。
我们首先来学习最常使用的标准曲线法计算待测液蛋白质浓度。这个表格中是一位同学做出的实验数据,他设计制作了标准曲线,并测定了一份纯蛋白质样品的吸光度A值,这是他的实验数据。
我们可以用三种方法来制作标准曲线,第一种是坐标纸描图法,具体操作是:取一张坐标纸,在下部画一条横线,这是横坐标,左侧画一条竖线,这是纵坐标。根据所设计标准蛋白质的浓度分布,在横坐标轴上标记出各浓度点,并注明“蛋白质浓度”和浓度的单位,紫外法的浓度单位是mg/ml。在纵坐标轴根据数据所测定的吸光度范围标记处各吸光度点,并注明A280,在图上注明“紫外法测定蛋白质浓度标准曲线图”的名称,这样标记后整个标准曲线图就变得一目了然,方便自己和其他人查看。根据标准曲线各浓度和吸光度的对应关系,在坐标纸上标记处每一个标准曲线点,然后用一条经过原点的直线将所有点连接在一起,注意因为操作误差有的点可能不完全符合线性,划线时应将各点在线上线下均匀分布,这条就是本次紫外法测定蛋白质浓度的标准曲线。计算3个平行样品吸光度的平均值,结果为0.359,在纵轴找到这个点,此点开始画一条横线,与标准曲线交叉点处再画一条竖线,竖线与横轴的交叉点,读数,即为待测样品的浓度,本次测定结果约为0.500。
第二种方法是利用Excel等软件绘制散点图,图上同样要注明横坐标“蛋白质浓度”和单位,纵坐标A280,以及图的名称“紫外法测定蛋白质浓度标准曲线图”,便于自己和其他人查看。
然后通过“添加趋势线”的方法将这些点连接,并显示公式和R2,这样我们就获得了一个方程式。
同样取待测样吸光度的平均值,0.359,带入方程计算出浓度
x=(0.359-0.008)÷0.6999=0.502,
所以这个待测样的浓度就是0.502mg/ml。
R2还可以告诉我们标准曲线的线性程度,R2越接近1,说明标准曲线的线性越强,如果R2降低,需要检查实验设计的浓度范围是否在线性范围内,以及实验操作是否正确。
除了坐标纸描点和软件制图以外,还可以直接用计算器或软件对标准曲线的数据进行计算,得到拟合方程和R2,然后将待测样的平均值带入方程计算出浓度。
可是,我们的计算还没有结束,同学们还记得我们配制待测样的加样体积吗?我们是用1ml原始的待测液加3ml水配制的,所以相当于对原始待测液稀释4倍后才进行测定。因此,我们之前计算出的待测液浓度还要乘以4,计算出待测蛋白质溶液的浓度为2.008。我们在测定时将样品稀释是为了使其吸光度值落在标准曲线的中段,减少相对误差,计算的时候一定要记得乘以稀释倍数,得出原始溶液的浓度。
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