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亲和层析

小时候你们都接种过疫苗吧，很多疫苗都是病原物的蛋白质，作为抗原，用它接种人体后，人体将获得相应的抗体。抗体是人体产生的免疫球蛋白，具有Y字形结构，在Y字的顶端有特异抗原结合的区域。当相同的病原物入侵人体后，抗体能够和病原物抗原结合形成复合物，进而激发细胞产生进一步的免疫反应，清除病原物，达到抵御疾病的目的。这是抗原和抗体的结合。

酶通过特异性地与底物结合，催化底物形成产物，这是酶与底物的结合特性。溶菌酶可以和细菌细胞壁底物肽聚糖聚合物特异结合，催化底物水解，破坏细菌细胞壁。此外别构酶除了底物结合特性外，别构酶还具有调节亚基，能够与特异的别构调节剂结合，调节酶的活性。天冬氨酸转氨甲酰酶是别构酶，具有结合别构调节剂的亚基，如CTP是别构抑制剂。这是别构酶与别构调节剂的特异结合。

细胞如何感知外界信号呢？细胞外的信号分子能够和细胞膜上的受体蛋白质特异结合，结合后将引发细胞发生一系列反应以响应外界信号。这是信号分子和细胞受体的特异结合。

伴刀豆球蛋白A是一种凝集素，最初从白刀豆中提取，具有糖的结合部位，能够与含有甘露糖、葡萄糖等特定单糖基团的具有特定结构的糖蛋白特异性结合。这是凝集素和糖蛋白的特异结合。当然，蛋白质还有很多其他结合特性。

了解了蛋白质的一些结合特性后，下面看看什么是亲和层析吧。

生物分子具有与某特定分子识别和结合的性质，亲和层析就是利用生物分子的这种特异结合能力而建立的对生物大分子进行有效分离纯化的方法。

亲和层析有3种通用技术，包括免疫亲和层析、凝集素亲和层析和染料亲和层析。免疫亲和层析是以抗体作为配基进行蛋白质分离纯化的技术； 凝集素亲和层析是以凝集素作为配基分离糖蛋白的技术。染料亲和层析是以染料为配基的蛋白质纯化技术。

通常情况下是将能够与生物分子专一结合的特定分子作为配基，将配基与水不溶性的载体偶联形成亲和层析的柱填料， 用于生物分子的分离。亲和层析法的具体原理：配基L和分子S一定具有特异结合的能力。首先，将配基（L）与亲和层析柱介质载体连接；其次，将含有目标分子S的混合物装柱，目标分子S将结合在层析柱介质载体的配基上，而杂质没有结合特性，被清洗除去；之后，再洗脱结合在配基上的目标蛋白质。

那如何选择配基呢？

在特定条件下，配基能够与目标蛋白专一性可逆结合，结合越紧密越好；

此外，配基和生物大分子结合后，改变洗脱液条件能够将配基和生物分子分离，而且生物大分子活性不被破坏；

再者，配基上有与载体相偶联的化学基团， 这些基团能够与载体结合，而且它们的结合不会影响配基与生物大分子的结合；

那常见的与配基结合的载体有哪些呢？

目前使用最广泛的载体有

•           琼脂糖（Sepharose）和葡聚糖凝胶（Sephadex）

下面让我们了解亲和层析技术的具体操作过程吧。

第一步：将配基与亲和层析介质，也就是刚才谈到的载体进行偶联

第二步：上样，就是将含有目标蛋白的混合物样品加入亲和层析柱，目标蛋白与介质上的配基紧密结合

第三步：清洗杂蛋白，就是用洗脱液将未结合的杂蛋白洗脱出来；

第四步 : 洗脱目标蛋白，就是用缓冲液将目标蛋白洗脱下来。

第五步：为了保证亲和层析柱的再次使用，在每次使用后，都需要用2mol/L KCl-6 mol/L尿素充分洗脱两次，并使用蛋白酶处理亲和柱，从而维持层析柱的寿命。

思考过吗？如何洗脱目标蛋白呢？

常见目标蛋白质洗脱方式，主要包括两种。一种是通过改变洗脱液的pH值、离子强度或者缓冲液组成来洗脱结合在亲和层析柱介质上的目标蛋白质。

另一种是利用高浓度的配基溶液作为洗脱液将结合在亲和层析柱介质上的目标蛋白质洗脱下来。

与其他层析不同，亲和层析具有很明显的优势：高效和简便

当将配基固定化到层析柱介质，也就是载体上之后， 通常情况下只要将样品加入层析柱，使目标蛋白和亲和柱介质的配基发生专一结合，之后就是洗脱杂质，最后再将目标物质洗脱下来，这种方式获得的目标物质有较高的纯度，并能将目标物质从含量极低的材料中分离获得。

以血浆中维生素B12结合蛋白为例，该蛋白在血浆中的含量仅为二十万分之一。如果用常规方法提取，产率很低，但是用亲和层析方法则产率较高。

在现实生活中，亲和层析纯化蛋白质和我们有着紧密的关系。

例如：目前酒精性肝病的诊断缺乏特异性生化指标。

在“植物凝集素亲和色谱层析法分离缺糖基转铁蛋白诊断酒精性肝病的临床研究”一文中提到酒精性肝病的诊断缺乏特异性生化指标。

国外学者对缺糖基转铁蛋白（CDT）进行了广泛研究，取得了许多进展，众多学者认为缺糖基转铁蛋白是至今唯一的较为特异性的诊断酒精性肝病的实验室指标。

那么如何检测缺糖基转铁蛋白的含量呢？

缺糖基转铁蛋白是糖蛋白，刚才谈到植物凝集素能够结合特定糖蛋白，因此研究人员应用与缺糖基转铁蛋白能够特异结合的植物凝集素亲和层析法分离血清中的该蛋白。然后与其他方法结合获得CDT／Tf 值，依据该比值对酒精性肝病进行诊断。


下一节:蛋白质的超速离心、透析和超滤

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基础生物化学实验课程列表：

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么？

--《生物化学实验》学什么？

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-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习？

--不同需求的同学如何学习本课程？

--不同需求的同学如何学习本课程？

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

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-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素（VB2）荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗？

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶比活力的测定（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力的计算（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力的计算（Folin酚法）

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶，想想怎么测？

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

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--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

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--拟南芥叶片基因组DNA提取

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--紫外分光光度法测定核酸

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子，如何纯化呢？

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳，还有什么用于生物大分子鉴定的方法？

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

亲和层析笔记与讨论

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