当前课程知识点:基础生物化学实验 >  第五章 物质的分离纯化 >  第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 >  亲和层析

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频课程列表

亲和层析在线视频

下一节:亲和层析

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频列表

亲和层析课程教案、知识点、字幕

同学们大家好

这个视频我将要向大家介绍

蛋白质分离纯化常见技术

亲和层析

依据结合特性进行蛋白质

分离纯化的技术

包括亲和层析和固定化金属

螯合亲和层析

先了解一下蛋白质都有哪些结合特性

小时候你们都接种过疫苗吧?

很多疫苗都是病原物的蛋白质

作为抗原

用它接种人体后

人体将获得相应的抗体

抗体是人体产生的免疫球蛋白

具有Y字形结构

在Y字的顶部有特异抗原结合的区域

当相同的病原物入侵人体后

抗体能够和病原物抗原

结合形成复合物

进而激发细胞产生进一步的免疫反应

清除病原物达到抵御疾病的目的

这就是抗原和抗体的结合

酶通过特异性的与底物结合

催化底物形成产物

这是酶与底物的结合特性

如图一所示

这是溶菌酶可以和细菌细胞壁

底物

肽聚糖聚合物特异结合

催化底物水解

破坏细菌细胞壁

此外

别构酶除了底物结合特性外

别构酶还具有调节亚基

能够与特异的别构调节剂结合

调节酶的活性

图2是天冬氨酸转氨甲酰酶

该酶就是别构酶

具有结合别构调节剂

的亚基

如CTP是别构抑制剂

这是别构酶与别构调节剂的特异结合

细胞如何感知外界信号呢?

细胞外的信号分子能够和细胞膜

上的受体蛋白特异结合后

引发细胞发生一系列反应

以响应外界信号

这是信号分子和细胞受体的特异结合

伴刀豆 球蛋白 A是一种凝集素

最初从白刀豆中提取

具有糖的结合部位

能够与含有甘露糖

葡萄糖等特定单糖

基团的具有特定结构的

糖蛋白特异性结合

这是凝集素和糖蛋白的特异结合

当然蛋白质还有很多其他结合特性

了解了蛋白质的一些结合特性后

下面让我们看看什么是亲和层析

生物分子具有与特定分子

识别结合的特性

亲和层析就是利用生物分子的这种

特异结合能力而建立的对生物大分子

进行有效分离 纯化的方法

亲和层析有三种通用技术

包括免疫亲和层析 凝集素

亲和层析

和染料亲和层析

免疫亲和层析是以抗体作为配基

进行蛋白质分离纯化的技术

凝集素亲和层析是以凝集素作为

配基分离糖蛋白的技术

染料亲和层析是以染料为配基

的蛋白质分离纯化技术

通常情况下是将能够与生物分子

专一结合的特定分子作为配基

将配基与水不溶性的载体偶联

形成亲和层析的柱填料

用于生物分子的分离

亲和层析法具体的原理如图所示

配基L和分子S

一定具有特异结合的能力

首先将配基L和亲和柱介质载体连接

其次将含有目标分子

S的混合物装柱

目标分子 S将结合在

层析柱介质载体的配基上

而杂质没有结合特性被清洗出去

之后再洗脱结合在配基

上的目标蛋白质

如何选择配基呢

在特定条件下配基能够与目标

蛋白专一性地可逆结合

结合越紧密越好

此外配基和生物大分子结合后

改变洗脱液条件

能够将配基和生物分子分离

而且生物大分子活性不被破坏

再者配基上有与

载体相偶联的化学基团

这些基团能够与载体结合

而且它们的结合不会影响配基

与生物大分子的结合

常见的与配基结合的载体又有哪些呢?

目前使用最广泛的载体有

 琼脂糖(Sepharose)

和葡聚糖(Sephadex)

下面让我们了解亲和层析

的具体操作过程

如图所示

第一步

将配基和亲和层析介质

也就是刚才谈到的载体进行偶联

之后上样就是将含有目标蛋白的

混合物样品加入亲和层析柱

目标蛋白与介质上的配基紧密结合

第三步清洗杂蛋白

就是用洗脱液将未结合

的杂蛋白洗脱下来

第四步

洗脱目标蛋白质

用缓冲液将目标蛋白洗脱下来

最后为了保证亲和层析柱的再次使用

在每次使用后都需要用

2mol/L氯化钾

6mol/L尿素充分洗脱两次

并使用蛋白酶处理亲和柱

从而维持层析柱的寿命

你思考过吗?

如何洗脱目标蛋白呢

常见目标蛋白的洗脱

方式主要包括两种

一种是通过改变洗脱液的pH值

离子强度或者缓冲液组成来洗脱

结合在亲和层析柱介质

上的目标蛋白质

另一种是利用高浓度的

配基溶液作为洗脱液

将结合在亲和层析柱介质上

的目标蛋白质洗脱下来

如视频所示

与其他程序不同

亲和层析具有很明显的优势

高效和简便

当将配基固定化到层析柱介质上后

也就是载体上之后

通常情况下

只要将

样品加入层析柱

使目标蛋白质和亲和柱介质

的配基发生专一结合

之后就是洗脱杂蛋白

最后再将目标物质洗脱下来

这种方式获得的目标

物质有较高的纯度

并能将目标物质从含量极

低的材料中分离获得

以血浆中维生素B12结合蛋白为例

该蛋白在血浆中的含量

仅为1/20,0000

如果用常规方法提取产率很低

但是如果用亲和层析法则产率较高

在现实生活中

亲和层析纯化蛋白质和

我们有着紧密的关系

例如目前酒精性肝病的诊断

缺乏特异性生化指标

在植物凝集素亲和色谱层析法 分离

缺糖基转铁蛋白

诊断酒精性肝病的临床

研究一文中提到

酒精性肝病的诊断缺乏

特异性生化指标

国外学者对缺糖基

转铁蛋白CDT进行了广泛的研究

取得了许多的进展

众多学者认为

缺糖基转铁蛋白是至今唯一的较为特

异性的诊断酒精性肝病的实验室指标

那么如何检测缺糖基

转铁蛋白的含量呢

缺糖基转铁蛋白是糖蛋白

刚才谈到植物凝集素能够

结合特定糖蛋白

因此研究人员应用

与缺糖基转铁蛋白能够特异

结合的植物凝集素

亲和层析方法分离血清中的该蛋白

然后与其他方法结合获得

CDT/Tf 比值

依据该比值对酒精性肝病进行诊断

以上就是这个视频的主要内容

下面让我对该视频进行小结

在这个视频中

我首先介绍了蛋白质的几种结合特性

之后说明了亲和层析操作的基本步骤

最后解释了亲和层析技术分离

纯化蛋白质的优越性

下一个视频我将介绍依据分子大小

进行蛋白质分离纯化的技术

等待你的参加啊!

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

--离子交换层析

--亲和层析

--亲和层析

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

亲和层析笔记与讨论

也许你还感兴趣的课程:

© 柠檬大学-慕课导航 课程版权归原始院校所有,
本网站仅通过互联网进行慕课课程索引,不提供在线课程学习和视频,请同学们点击报名到课程提供网站进行学习。