当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > 亲和层析
同学们大家好
这个视频我将要向大家介绍
蛋白质分离纯化常见技术
亲和层析
依据结合特性进行蛋白质
分离纯化的技术
包括亲和层析和固定化金属
螯合亲和层析
先了解一下蛋白质都有哪些结合特性
小时候你们都接种过疫苗吧?
很多疫苗都是病原物的蛋白质
作为抗原
用它接种人体后
人体将获得相应的抗体
抗体是人体产生的免疫球蛋白
具有Y字形结构
在Y字的顶部有特异抗原结合的区域
当相同的病原物入侵人体后
抗体能够和病原物抗原
结合形成复合物
进而激发细胞产生进一步的免疫反应
清除病原物达到抵御疾病的目的
这就是抗原和抗体的结合
酶通过特异性的与底物结合
催化底物形成产物
这是酶与底物的结合特性
如图一所示
这是溶菌酶可以和细菌细胞壁
底物
肽聚糖聚合物特异结合
催化底物水解
破坏细菌细胞壁
此外
别构酶除了底物结合特性外
别构酶还具有调节亚基
能够与特异的别构调节剂结合
调节酶的活性
图2是天冬氨酸转氨甲酰酶
该酶就是别构酶
具有结合别构调节剂
的亚基
如CTP是别构抑制剂
这是别构酶与别构调节剂的特异结合
细胞如何感知外界信号呢?
细胞外的信号分子能够和细胞膜
上的受体蛋白特异结合后
引发细胞发生一系列反应
以响应外界信号
这是信号分子和细胞受体的特异结合
伴刀豆 球蛋白 A是一种凝集素
最初从白刀豆中提取
具有糖的结合部位
能够与含有甘露糖
葡萄糖等特定单糖
基团的具有特定结构的
糖蛋白特异性结合
这是凝集素和糖蛋白的特异结合
当然蛋白质还有很多其他结合特性
了解了蛋白质的一些结合特性后
下面让我们看看什么是亲和层析
生物分子具有与特定分子
识别结合的特性
亲和层析就是利用生物分子的这种
特异结合能力而建立的对生物大分子
进行有效分离 纯化的方法
亲和层析有三种通用技术
包括免疫亲和层析 凝集素
亲和层析
和染料亲和层析
免疫亲和层析是以抗体作为配基
进行蛋白质分离纯化的技术
凝集素亲和层析是以凝集素作为
配基分离糖蛋白的技术
染料亲和层析是以染料为配基
的蛋白质分离纯化技术
通常情况下是将能够与生物分子
专一结合的特定分子作为配基
将配基与水不溶性的载体偶联
形成亲和层析的柱填料
用于生物分子的分离
亲和层析法具体的原理如图所示
配基L和分子S
一定具有特异结合的能力
首先将配基L和亲和柱介质载体连接
其次将含有目标分子
S的混合物装柱
目标分子 S将结合在
层析柱介质载体的配基上
而杂质没有结合特性被清洗出去
之后再洗脱结合在配基
上的目标蛋白质
如何选择配基呢
在特定条件下配基能够与目标
蛋白专一性地可逆结合
结合越紧密越好
此外配基和生物大分子结合后
改变洗脱液条件
能够将配基和生物分子分离
而且生物大分子活性不被破坏
再者配基上有与
载体相偶联的化学基团
这些基团能够与载体结合
而且它们的结合不会影响配基
与生物大分子的结合
常见的与配基结合的载体又有哪些呢?
目前使用最广泛的载体有
琼脂糖(Sepharose)
和葡聚糖(Sephadex)
下面让我们了解亲和层析
的具体操作过程
如图所示
第一步
将配基和亲和层析介质
也就是刚才谈到的载体进行偶联
之后上样就是将含有目标蛋白的
混合物样品加入亲和层析柱
目标蛋白与介质上的配基紧密结合
第三步清洗杂蛋白
就是用洗脱液将未结合
的杂蛋白洗脱下来
第四步
洗脱目标蛋白质
用缓冲液将目标蛋白洗脱下来
最后为了保证亲和层析柱的再次使用
在每次使用后都需要用
2mol/L氯化钾
6mol/L尿素充分洗脱两次
并使用蛋白酶处理亲和柱
从而维持层析柱的寿命
你思考过吗?
如何洗脱目标蛋白呢
常见目标蛋白的洗脱
方式主要包括两种
一种是通过改变洗脱液的pH值
离子强度或者缓冲液组成来洗脱
结合在亲和层析柱介质
上的目标蛋白质
另一种是利用高浓度的
配基溶液作为洗脱液
将结合在亲和层析柱介质上
的目标蛋白质洗脱下来
如视频所示
与其他程序不同
亲和层析具有很明显的优势
高效和简便
当将配基固定化到层析柱介质上后
也就是载体上之后
通常情况下
只要将
样品加入层析柱
使目标蛋白质和亲和柱介质
的配基发生专一结合
之后就是洗脱杂蛋白
最后再将目标物质洗脱下来
这种方式获得的目标
物质有较高的纯度
并能将目标物质从含量极
低的材料中分离获得
以血浆中维生素B12结合蛋白为例
该蛋白在血浆中的含量
仅为1/20,0000
如果用常规方法提取产率很低
但是如果用亲和层析法则产率较高
在现实生活中
亲和层析纯化蛋白质和
我们有着紧密的关系
例如目前酒精性肝病的诊断
缺乏特异性生化指标
在植物凝集素亲和色谱层析法 分离
缺糖基转铁蛋白
诊断酒精性肝病的临床
研究一文中提到
酒精性肝病的诊断缺乏
特异性生化指标
国外学者对缺糖基
转铁蛋白CDT进行了广泛的研究
取得了许多的进展
众多学者认为
缺糖基转铁蛋白是至今唯一的较为特
异性的诊断酒精性肝病的实验室指标
那么如何检测缺糖基
转铁蛋白的含量呢
缺糖基转铁蛋白是糖蛋白
刚才谈到植物凝集素能够
结合特定糖蛋白
因此研究人员应用
与缺糖基转铁蛋白能够特异
结合的植物凝集素
亲和层析方法分离血清中的该蛋白
然后与其他方法结合获得
CDT/Tf 比值
依据该比值对酒精性肝病进行诊断
以上就是这个视频的主要内容
下面让我对该视频进行小结
在这个视频中
我首先介绍了蛋白质的几种结合特性
之后说明了亲和层析操作的基本步骤
最后解释了亲和层析技术分离
纯化蛋白质的优越性
下一个视频我将介绍依据分子大小
进行蛋白质分离纯化的技术
等待你的参加啊!
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试



