当前课程知识点:基础生物化学实验 >  第三章 物质的定量测定 >  第一节 蛋白质的定量测定 >  Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频课程列表

Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法在线视频

下一节:Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频列表

Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法课程教案、知识点、字幕

身为生命科学专业的学生

你知道全世界被引用最多

的论文是讲什么的吗

2014年著名的科学杂志《Nature》

提出了这个问题

并且请

拥有SCI的汤森路透

列出了从1900年至今公开发表

的被引用量最高的100篇论文

论文涵盖了生物学 数学 物理化学

医学

心理学等学科

其中引用率最高的6篇论文

都是生物科学的论文

而排名第一的一篇已经被

引用超过了30万次

这是一篇发表于1951年在生物化学

杂志上关于蛋白质测定的科研论文

那么是什么样的论文如此

受到全球科学家的青睐

这篇论文讲的就是我们今天要做的这个实验

Lowry法测定蛋白质的浓度

这个方法得名于其作者的名字oliver Lowry

下面让我们一起来看看这个

方法到底是怎么回事

Lowry法测定蛋白质浓度的方法

是利用一种特殊的试剂与蛋白质发生反应

生成蓝色的物质

生成蓝色物质的量与溶液

中蛋白质的浓度成正比

这种试剂叫做Folin-Ciocalteu

试剂

一般翻译成福林-乔卡梯奥试剂

简称FCR

也就是我们常说的福林酚试剂

在有些文献中也被称为福林

丹尼斯试剂(Folin–Denis reagent)

这些名称都来自于和试剂建立有关

的Otto Folin等三位科学家的名字

这个试剂的主要成分是磷钨酸和磷钼酸

配制方法很复杂

一般我们都是直接从试剂公司购置

早在1927年的时候

这个试剂就被用来测量赖氨酸的含量

或者是在食品行业中用于测定

植物产品中的酚含量

1951年的时候

生物化学家Oliver H. Lowry改进前人的方法

建立了用福林酚试剂测定

蛋白质浓度的方法

并且在生物化学杂志上发表了题为

《Folin酚法测定蛋白质的浓度》的科研论文

所以这个方法常常被称作

Lowry法或者Folin酚法

这个方法一出来

就因为它的灵敏度高 显色稳定等优点

立即成为实验室最常用的测定方法之一

所以说已经累计被引用超过了30万次

下面我们一起来看看如何利用这个著名的方法

测定一个未知样品的蛋白质浓度

Lowry法的测定可以分成两步

分别用到试剂甲和试剂乙

其中

试剂甲一般是用A液和B液按照

50:1的比例配制成混合液

这个混合液的有效期只能保持一天

过期就会失效

试剂甲A液的配制方法是把10克

碳酸钠

两克氢氧化钠

0.5克 酒石酸钾钠溶解后

用蒸馏水定容到500毫升

而试剂乙的溶液则是用

0.5克五水合硫酸铜溶解后

用蒸馏水定容到100毫升

也就是0.5%的五水合硫酸铜溶液

每次使用前把A液和B液按照

50:1的比例配成混合液

当天使用

本实验所用的试剂购自于

sigma公司原液为两个当量

用前稀释一倍使用

请注意

用棕色的玻璃瓶避光保存

Lowry法的测定范围为20~250

微克每毫升的蛋白质

所以标准曲线的浓度一般也设定在这个范围内

比如说我现在就使用250微克每毫升

的蛋白质标准液来配置标准曲线

设计标准曲线的最终

体积为

一毫升

按照这个表中的

体积

分别加入水和蛋白质标准液

就可以得到一系列

体积为

一毫升浓度从0~250微克每毫升之间

不同浓度梯度的

蛋白质溶液

未知样品也加入一毫升

请注意

未知样品的估测浓度应该是在25

~250微克每毫升的范围内

我们可以通过梯度稀释

的预实验来进行确认

标准曲线

和样品依次加入试剂甲五毫升

室温放置5分钟

在此期间试剂甲中的二价铜离子Cu2+

和蛋白质形成络合物

并且与蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸

残基侧链在碱性的条件下发生反应

生成一价铜离子Cu+

5分钟以后

蛋白质标准曲线管和样品管中依次加入

0.5毫升一个当量的福林酚试剂乙

请注意

加入试剂乙之后要立即混匀

确保试剂乙中的磷钨酸和磷钼酸

及时与蛋白质和一价铜离子Cu+

的络合物发生氧化还原反应

生成蓝色物质钨蓝和钼蓝

这个反应的机理我们还不完全清楚

它所生成的蓝色物质在30

分钟左右达到稳定的量

由于这个反应产物的结构还不清楚

它在可见光的红光区呈现

比较宽的吸收峰区

所以不同的实验指导会选择

不同的波长作为检测波长

常用的是640~660纳米

700纳米

或者是750纳米

本次实验我们采用650纳米处进行测定

等待的时候请打开分光光度计的电源

预热30分钟

本次实验操作使用的是

722N型分光光度计

相关的原理和使用注意事项

请参考722N分光光度计的设计

设计原理和操作规范课程视频

首先设置波长为650纳米

打开样品池盖调节仪器的透光率0%

然后关闭样品池盖

并以标准

曲线的第一管为空白管

调节仪器的透光率100%

检查空白管的吸光度值为0

拉动样品池拉杆

依次测定标准曲线各管的吸光度值

请注意

按照我们前面学过的方法

正确润洗比色杯

测定完标准曲线后用水

彻底清洗比色杯

正确润洗

并测定样品

请注意

平行样

尽量在一组内进行测定以减少误差

测定完成后

以标准曲线

样品的浓度为横坐标

以每个样品吸光度值为纵坐标

绘制标准曲线

并且根据未知

样品的吸光度值计算未知样品的浓度

试剂加入的

体积可以根据

个人需要按比例进行调整

这个方法操作简便

灵敏度高

但是也会受到Tris蔗糖

硫酸氨

巯基化合物酚类和柠檬酸

等多种物质的干扰

而含量较低的尿素 胍 硫酸钠 硝酸钠

三氯乙酸

乙醇

乙醚

丙酮

就不会对显色产生影响

请大家在操作的时候注意这些影响的产生

需要特别注意的是

福林酚试剂因为含有氯化锂 磷钨酸

磷钼酸和磷酸等酸性物质

属于危险试剂

会造成一系列的污染和伤害

所以请务必小心保管和使用

使用后按照相关的规定进行排放

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

--离子交换层析

--亲和层析

--亲和层析

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法笔记与讨论

收藏文章
表情删除后不可恢复,是否删除
取消
确定
图片正在上传,请稍后...
  • 评分:
评论内容为空!
还没有评论,快来抢沙发吧!

也许你还感兴趣的课程:

© 柠檬大学-慕课导航 课程版权归原始院校所有,
本网站仅通过互联网进行慕课课程索引,不提供在线课程学习和视频,请同学们点击报名到课程提供网站进行学习。
欢迎学习『Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法慕课视频播放-基础生物化学实验-MOOC慕课视频教程-柠檬大学』