当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第一节 蛋白质的定量测定 > Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法
身为生命科学专业的学生
你知道全世界被引用最多
的论文是讲什么的吗
2014年著名的科学杂志《Nature》
提出了这个问题
并且请
拥有SCI的汤森路透
列出了从1900年至今公开发表
的被引用量最高的100篇论文
论文涵盖了生物学 数学 物理化学
医学
心理学等学科
其中引用率最高的6篇论文
都是生物科学的论文
而排名第一的一篇已经被
引用超过了30万次
这是一篇发表于1951年在生物化学
杂志上关于蛋白质测定的科研论文
那么是什么样的论文如此
受到全球科学家的青睐
这篇论文讲的就是我们今天要做的这个实验
Lowry法测定蛋白质的浓度
这个方法得名于其作者的名字oliver Lowry
下面让我们一起来看看这个
方法到底是怎么回事
Lowry法测定蛋白质浓度的方法
是利用一种特殊的试剂与蛋白质发生反应
生成蓝色的物质
生成蓝色物质的量与溶液
中蛋白质的浓度成正比
这种试剂叫做Folin-Ciocalteu
试剂
一般翻译成福林-乔卡梯奥试剂
简称FCR
也就是我们常说的福林酚试剂
在有些文献中也被称为福林
丹尼斯试剂(Folin–Denis reagent)
这些名称都来自于和试剂建立有关
的Otto Folin等三位科学家的名字
这个试剂的主要成分是磷钨酸和磷钼酸
配制方法很复杂
一般我们都是直接从试剂公司购置
早在1927年的时候
这个试剂就被用来测量赖氨酸的含量
或者是在食品行业中用于测定
植物产品中的酚含量
1951年的时候
生物化学家Oliver H. Lowry改进前人的方法
建立了用福林酚试剂测定
蛋白质浓度的方法
并且在生物化学杂志上发表了题为
《Folin酚法测定蛋白质的浓度》的科研论文
所以这个方法常常被称作
Lowry法或者Folin酚法
这个方法一出来
就因为它的灵敏度高 显色稳定等优点
立即成为实验室最常用的测定方法之一
所以说已经累计被引用超过了30万次
下面我们一起来看看如何利用这个著名的方法
测定一个未知样品的蛋白质浓度
Lowry法的测定可以分成两步
分别用到试剂甲和试剂乙
其中
试剂甲一般是用A液和B液按照
50:1的比例配制成混合液
这个混合液的有效期只能保持一天
过期就会失效
试剂甲A液的配制方法是把10克
碳酸钠
两克氢氧化钠
0.5克 酒石酸钾钠溶解后
用蒸馏水定容到500毫升
而试剂乙的溶液则是用
0.5克五水合硫酸铜溶解后
用蒸馏水定容到100毫升
也就是0.5%的五水合硫酸铜溶液
每次使用前把A液和B液按照
50:1的比例配成混合液
当天使用
本实验所用的试剂购自于
sigma公司原液为两个当量
用前稀释一倍使用
请注意
用棕色的玻璃瓶避光保存
Lowry法的测定范围为20~250
微克每毫升的蛋白质
所以标准曲线的浓度一般也设定在这个范围内
比如说我现在就使用250微克每毫升
的蛋白质标准液来配置标准曲线
设计标准曲线的最终
体积为
一毫升
按照这个表中的
体积
分别加入水和蛋白质标准液
就可以得到一系列
体积为
一毫升浓度从0~250微克每毫升之间
不同浓度梯度的
蛋白质溶液
未知样品也加入一毫升
请注意
未知样品的估测浓度应该是在25
~250微克每毫升的范围内
我们可以通过梯度稀释
的预实验来进行确认
标准曲线
和样品依次加入试剂甲五毫升
室温放置5分钟
在此期间试剂甲中的二价铜离子Cu2+
和蛋白质形成络合物
并且与蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸
残基侧链在碱性的条件下发生反应
生成一价铜离子Cu+
5分钟以后
蛋白质标准曲线管和样品管中依次加入
0.5毫升一个当量的福林酚试剂乙
请注意
加入试剂乙之后要立即混匀
确保试剂乙中的磷钨酸和磷钼酸
及时与蛋白质和一价铜离子Cu+
的络合物发生氧化还原反应
生成蓝色物质钨蓝和钼蓝
这个反应的机理我们还不完全清楚
它所生成的蓝色物质在30
分钟左右达到稳定的量
由于这个反应产物的结构还不清楚
它在可见光的红光区呈现
比较宽的吸收峰区
所以不同的实验指导会选择
不同的波长作为检测波长
常用的是640~660纳米
700纳米
或者是750纳米
本次实验我们采用650纳米处进行测定
等待的时候请打开分光光度计的电源
预热30分钟
本次实验操作使用的是
722N型分光光度计
相关的原理和使用注意事项
请参考722N分光光度计的设计
设计原理和操作规范课程视频
首先设置波长为650纳米
打开样品池盖调节仪器的透光率0%
然后关闭样品池盖
并以标准
曲线的第一管为空白管
调节仪器的透光率100%
检查空白管的吸光度值为0
拉动样品池拉杆
依次测定标准曲线各管的吸光度值
请注意
按照我们前面学过的方法
正确润洗比色杯
测定完标准曲线后用水
彻底清洗比色杯
正确润洗
并测定样品
请注意
平行样
尽量在一组内进行测定以减少误差
测定完成后
以标准曲线
样品的浓度为横坐标
以每个样品吸光度值为纵坐标
绘制标准曲线
并且根据未知
样品的吸光度值计算未知样品的浓度
试剂加入的
体积可以根据
个人需要按比例进行调整
这个方法操作简便
灵敏度高
但是也会受到Tris蔗糖
硫酸氨
巯基化合物酚类和柠檬酸
等多种物质的干扰
而含量较低的尿素 胍 硫酸钠 硝酸钠
三氯乙酸
乙醇
乙醚
丙酮
就不会对显色产生影响
请大家在操作的时候注意这些影响的产生
需要特别注意的是
福林酚试剂因为含有氯化锂 磷钨酸
磷钼酸和磷酸等酸性物质
属于危险试剂
会造成一系列的污染和伤害
所以请务必小心保管和使用
使用后按照相关的规定进行排放
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
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-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
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-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
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-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
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-第二章 离心机的使用 作业
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-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
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-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试