当前课程知识点:基础生物化学实验 >  第五章 物质的分离纯化 >  第二节 核酸的提取和检测 >  核酸的制备原理及基本步骤

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核酸的制备原理及基本步骤

大家或多或少都对核酸有一定的认识。核酸分为核糖核酸RNA和脱氧核糖核酸DNA。DNA是遗传物质,存在于真核生物的细胞核中,原核生物大肠杆菌DNA存在于细胞的拟核区

真核生物细胞中的基因组DNA,是双链线性分子,其基本结构单位是组蛋白和DNA形成的核小体。原核生物的基因组DNA,是双链环形分子,它与DNA结合蛋白及RNA形成特定结构。由此可知DNA总是和蛋白质结合在一起。

那当你分离制备DNA时,最需要解决的问题自然就是如何更好地去除蛋白质,获得DNA。其次,DNA是具有生理活性的生物大分子,如果在制备过程中,DNA发生降解、变性、或者断裂,或者提取的DNA样品中含有其他杂质,那你的DNA制备就是失败的,所以,制备DNA时,一定要保持其完整性和保持DNA的纯度

那如何在实验过程中获得完好的DNA分子呢?

首先需要注意避免化学物质对DNA的降解。过酸或者过碱以及一些化学物质都有可能导致DNA发生降解,因此提取制备DNA时,提取缓冲液pH范围最好保持在5.5~9.0之间。

其次,注意避免核酸的生物降解。细胞内各种核酸酶都有可能切断DNA分子中脱氧核糖核苷酸之间的3¢,5¢-磷酸二酯键,导致核酸降解。因此在提取DNA的缓冲液中需要加入抑制DNase酶活性的物质,比如EDTA(乙二胺四乙酸)、柠檬酸盐等物质,以鳌合DNase酶发挥作用所需要的金属离子Mg2+

还有一点非常重要的,值得注意的是:对于真核生物基因组DNA这种长的线状分子而言,机械损伤是导致你无法分离获到完整DNA分子的重要原因,所以在DNA制备过程中,绝对不能采用强烈振荡,剧烈搅拌,以及高温煮沸等操作步骤。

为了消除DNA制备样品中的微量RNA,最有效的方法是加入RNase酶来降解DNA样品中微量的RNA杂质。

以上是DNA制备的原则,换句话说就是分离DNA的时,不仅要保持DNA一级结构的完整性,还要排除蛋白质等其他物质以及RNA的污染。

了解了DNA制备的原则,那制备DNA具有哪些基本步骤呢?  

第一,需要将DNA从细胞中释放出来。

因此,破碎组织和细胞是第一步。动物组织比较脆弱,简单的机械匀浆或者组织研磨就可以破碎细胞;而植物和微生物组织存在细胞壁比较牢固,可分别采用组织捣碎法、超声波破碎等方法。在此过程中,常常会加入溶菌酶破坏细菌细胞壁,加入SDS,即十二烷基硫酸钠,该物质能够破坏植物细胞壁和细胞膜。SDS不仅是很好的细胞消溶剂,而且具有抑制核酸酶的作用,还能使细胞内蛋白质发生变性,达到将DNA和与之结合紧密的蛋白质、以及其他蛋白质有效分离的目的。

当细胞破碎后,进一步的操作就是需要去除细胞中的蛋白质、脂质、多糖等杂质。刚才说的SDS就有去除蛋白质的作用,此外,还有很多方法,例如酚抽提法、浓盐法,CTAB法等等。这里简单介绍一下CTAB, CTAB(cetyltriethylammonium bromide),也就是十六烷基三乙基溴化铵,是一种去污剂,用于抽提DNA。该试剂不仅能够溶解细胞膜,而且能够与核酸形成复合物。在特定条件下,研究人员可以将核酸- CTAB复合物与蛋白质、多糖等杂质分开,达到制备核酸的目的。

 

通过应用上述不同蛋白质去除的方法,你就可以获得DNA样品。但是注意,此时你获得的DNA溶液可能仍然含有一些低分子类物质、或者含有少量高分子量蛋白质、粘多糖,或者含有微量的RNA。所以还需要完成核酸的纯化过程。核酸纯化的方法有很多,例如超速离心法、柱层析法、凝胶电泳等等,这里就不进行介绍了。


下一节:质粒DNA的提取制备

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基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

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-第二节 本课程评分标准

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-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

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-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

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-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

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--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

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-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

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--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

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-第四章 酶活力的测定 作业

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-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

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--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

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--拟南芥叶片基因组DNA提取

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--紫外分光光度法测定核酸

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

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--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

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--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

核酸的制备原理及基本步骤笔记与讨论

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