当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > 蛋白质的盐析提纯
依据溶解度的蛋白质分离纯化技术包括盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等。细心的同学可以发现,依据蛋白质带电性质分离也包括等电点分离的方法。其实你不必感到疑惑,因为等电点沉淀是通过改变蛋白质的带电性质,进而改变了蛋白质的溶解度,导致蛋白质沉淀的方法,该方法涉及蛋白质带电性质,也涉及溶解度,所以两个分类依据下都有等电点沉淀。
如图1所示,烧杯中的溶液中含有三种蛋白质A、B和C;如图2所示,如果我通过给烧杯中加入某种物质,降低了A蛋白的溶解度,使其从溶液中沉淀出来,之后通过离心,我就可以获得蛋白A沉淀和含有B和C蛋白质的上清液,如此就可以将蛋白A与蛋白B和C分离开来。其实依据蛋白质溶解度进行蛋白质分离纯化的本质就是如此。如果A蛋白是目标蛋白,那我分离纯化的策略是沉淀目标蛋白,如果A蛋白不是目标蛋白,那我分离的策略就是沉淀杂蛋白。
下面的问题就是我加入什么物质,如何让某些蛋白质发生沉淀,而某些蛋白质又以溶解状态存在呢?这势必涉及到蛋白质的溶解度概念,以及改变蛋白质溶解度的因素有哪些?
首先来看看什么是蛋白质的溶解度吧?
溶解度是指在一定条件下,蛋白质作为有机大分子在水中以胶体状态存在。蛋白质在水中的分散量或分散水平相应地被称为蛋白质的溶解度(solubility)。
蛋白质的溶解状态与蛋白质的特性,例如带电荷的性质、数量、分子表面亲水基团和疏水基团的比例等有关系。
如图所示。组成蛋白质的某些氨基酸带有极性基团,如羧基、羟基、氨基等,它们可以和水分子相互作用,在蛋白质表面形成水化膜,致使蛋白质分子之间的相互作用降低,溶解性增加,蛋白质分子分散在溶液中。
在一定条件下蛋白质中某些氨基酸侧链极性基团可以发生解离,结果蛋白质分子带有一定的电荷,蛋白质分子可以和溶液中的带相反电荷的离子之间发生相互作用形成双电层,分子之间相互排斥力增加,蛋白质溶解性增加,蛋白质分散在溶液中,以溶解状态存在。
通过上面的讲解,同学们了解了蛋白质溶解的本质,知道不同蛋白质,由于其本身的分子结构不同,在同一特定条件下,应该具有不同的溶解度。
那影响蛋白质溶解度的外部因素又有哪些呢?研究人员可以通过改变影响蛋白质溶解度的相关因素,致使蛋白质混合物样品中,目标蛋白质或者杂蛋白溶解度降低而聚集沉底,达到分离它们的目的。
影响蛋白质溶解度的外部因素有以下几点:离子强度、介电常数、pH值及温度等。
通过加入中性盐能够改变蛋白质溶液的离子强度,这种方式是盐析;通过加入酸或者碱,改变蛋白质溶液的pH值,属于等电点沉淀; 通过加入有机溶剂,改变蛋白质溶液的介电常数,属于有机溶剂沉淀。
盐析是蛋白质分离纯化常用的技术之一。
当蛋白质溶液盐浓度比较低时,随着少量中性盐的加入,蛋白溶液盐浓度不断增加,蛋白质溶解性也随之增加,这种现象被称为盐溶(Salt in);但随着盐浓度的继续增加,蛋白质会聚集发生沉淀,这种现象被称为盐析(Salting out)。
盐析的本质是由于溶液离子强度增加,本来与蛋白质互作的水分子被加入的中性盐抢夺,水分子与中性盐互作,蛋白质水化膜被破坏,蛋白质表面的疏水基团外露,分子间相互作用增强而发生聚集沉淀。
谈到蛋白质沉淀,同学们需要知道,蛋白质沉淀包括变性沉淀和非变性沉淀
首先复习一下蛋白质变性的概念。
蛋白质变性是指维持蛋白质高级结构的作用力,例如氢键、疏水相互作用、离子键等被破坏,致使蛋白质高级结构被破坏,蛋白质失去功能的现象。
当维持蛋白质溶解的条件被改变时,蛋白质会发生沉淀。如果沉淀的蛋白质高级结构被破坏,这种沉淀就是变性沉淀;如果沉淀的蛋白质高级结构仍然维持完好,具有功能,这种沉淀就是非变性沉淀。
运用盐析进行蛋白质分离纯化时,只要操作得当,是有希望能够获得非变性沉淀蛋白质的,这一点对分离纯化蛋白质非常重要。
以上是本视频的主要内容,下面我将对本部分内容进行小结
在这个视频中,我首先介绍了影响蛋白质溶解度的外部因素,之后给出了盐溶与盐析的概念,解释了蛋白质变性沉淀和非变性沉淀,最后讲解了盐析分离蛋白质的原理。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试