当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第二章 生命科学三大必备仪器的使用 > 第五节 分光光度法测定待测物浓度 > 分光光度法测定物质浓度的实验设计
我们在前面的学习中,已经学习了分光光度法测定物质浓度的原理,今天我们一起来思考当你要设计一个分光光度法测定物质浓度的实验时,你的思路是什么,需要注意什么。
对于本身就具有光吸收的物质来说,相对比较简单,我们主要需要考虑的是以下3个方面:
首先,选择什么波长来进行测定。我们知道,每一种物质在光谱不同波段的吸光度不同,比如我们前面讲过:蛋白质中的酪氨酸和色氨酸在紫外区有光吸收,通过这张吸收光谱图我们可以看出在250nm到300nm的紫外光区中,两种氨基酸在280nm附近的吸光度最强,所以,我们一般把蛋白质的定量测定波长定在280nm。这就是我们设计分光光度法实验的第一个原则:一般选用物质光吸收最强的波长进行测定。
确定波长后,我们还要确定待测物的浓度范围,也就是标准曲线和待测样品的浓度大致在什么范围。这个范围的选择的原则一般为:标准曲线的吸光度分布在0.2-0.8的范围内,也可以拓展到0.2-1的范围,但必须要保证标准曲线各样品的吸光度和浓度成正比。在此范围内,设计方便加样的体积即可。而待测浓度样品要通过预实验初步确定大致浓度,测定前将其稀释到吸光度值落在标准曲线的中段。因为根据理论推导计算,分光光度法测定误差最小的点为吸光度值为0.434,透光率为36.8%,所以应尽量让待测物的吸光度值在此周围,减小相对误差。
比如,这是一位同学做的紫外法测定蛋白质浓度标准曲线,加样体积、标准曲线浓度和吸光度值。
除了以上两点,第三项要考虑的问题是对照管的设计。
我们学习分光光度计用法的时候已经知道,测定样品浓度前需要将比色杯反射、折射和溶剂的影响去除掉,这只用于去除非待测物影响的样品,我们一般称为“空白管”,将其设计为标准曲线的第一管,在实际测定操作中用于调节透光率T=100%。对于本身就有光吸收的物质,空白管的设计,一般只需用溶解待测物的溶剂即可,比如上述蛋白质测定实验中,标准蛋白溶液是水溶液,溶剂只有水,所以,用作空白管来扣除影响的就是纯水。
前面我们也学过,很多物质本身实际上并不具有光吸收,或者需要与试剂反应来增强吸光度,提高灵敏度,那这些通过发生化学反应生成有色物质来进行测定的实验设计上有什么不同吗?
首先,波长的选择,一般也是选择所生成的有光吸收的物质的最大光吸收波长。不过有时候我们也需要考虑残余的反应试剂带来的影响,如果反应试剂和产物的吸光度有重叠,则要考虑选择反应试剂影响比较小而产物光吸收又比较强的波长来进行测定,而不一定是产物的最大光吸收波长。
比如图中的反应物和产物,在产物吸光度最强的“波长1”处,反应物也有一定的光吸收,会对最后的测定和计算造成误差,这种情况下,就应该选择“波长2”进行产物的测定,尽可能排除反应物对吸光度的影响。
其次,关于吸光度范围的选择原则是一致的,尽量让吸光度落在0.2-0.8的范围内,需要注意的是,有些物质与反应物发生反应受到条件的限制,线性范围较窄,此时就应该选择产物与待测物浓度呈线性的吸光度范围设计实验,不一定非达到0.8。
此外,有些产物的生成需要一定的时间过程,或者所生成产物只在一定的时间内稳定存在,这时候就要在操作中严格控制操作时间。
第三,对照管的设计。对于需要发生反应才能生成有色物质的实验来说,对照管的设计出了要扣除溶剂影响以外,还要扣除反应物的影响,所以对照管中除了溶剂,还需要与其他测定管等量等比例加入所有反应试剂,也就是,除了你的待测物不加以外,其他试剂都按比例等量加入,而且保证和其他样品管反应条件完全一致,用这样的空白管调仪器透光率T=100%,就可以一次性扣除掉所有试剂带来的影响。比如我们用双缩脲试剂测定蛋白质浓度的实验中,标准曲线是这样设计的,用第一管作为空白管调透光率100%,就可以扣除掉比色杯、溶剂和双缩脲试剂等所有影响。
此外,有些特殊情况下,如果反应体系中有些物质光吸收比较强,会影响测定,还可以加入一定的掩蔽剂,让待测物之外的干扰物发生络合反应等,使其颜色不会影响测定,但是要注意,所有样品中加入的试剂必须保持一致。
还有一点要说明的是,分光光度法的测定只适用于均匀溶液,对于浑浊溶液来说,入射光会因散射损失,导致吸光度增加,标准曲线偏离线性。
所以务必要保证测定体系为均匀的溶液。
以上就是大家在设计分光光度法测定物质浓度的实验中需要考虑的主要几方面因素和注意事项,实际工作中可能还需要根据反应原理和特点进行调整,如果你在实践中遇到了问题,欢迎在论坛与大家讨论。
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