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分光光度法测定物质浓度的实验设计

我们在前面的学习中,已经学习了分光光度法测定物质浓度的原理,今天我们一起来思考当你要设计一个分光光度法测定物质浓度的实验时,你的思路是什么,需要注意什么。

对于本身就具有光吸收的物质来说,相对比较简单,我们主要需要考虑的是以下3个方面:

首先,选择什么波长来进行测定。我们知道,每一种物质在光谱不同波段的吸光度不同,比如我们前面讲过:蛋白质中的酪氨酸和色氨酸在紫外区有光吸收,通过这张吸收光谱图我们可以看出在250nm到300nm的紫外光区中,两种氨基酸在280nm附近的吸光度最强,所以,我们一般把蛋白质的定量测定波长定在280nm。这就是我们设计分光光度法实验的第一个原则:一般选用物质光吸收最强的波长进行测定。


第二章 第五节 1 酪氨酸光谱图.png


确定波长后,我们还要确定待测物的浓度范围,也就是标准曲线和待测样品的浓度大致在什么范围。这个范围的选择的原则一般为:标准曲线的吸光度分布在0.2-0.8的范围内,也可以拓展到0.2-1的范围,但必须要保证标准曲线各样品的吸光度和浓度成正比。在此范围内,设计方便加样的体积即可。而待测浓度样品要通过预实验初步确定大致浓度,测定前将其稀释到吸光度值落在标准曲线的中段。因为根据理论推导计算,分光光度法测定误差最小的点为吸光度值为0.434,透光率为36.8%,所以应尽量让待测物的吸光度值在此周围,减小相对误差。

比如,这是一位同学做的紫外法测定蛋白质浓度标准曲线,加样体积、标准曲线浓度和吸光度值。

第二章 第五节 2 紫外加样量表.png


除了以上两点,第三项要考虑的问题是对照管的设计。

我们学习分光光度计用法的时候已经知道,测定样品浓度前需要将比色杯反射、折射和溶剂的影响去除掉,这只用于去除非待测物影响的样品,我们一般称为“空白管”,将其设计为标准曲线的第一管,在实际测定操作中用于调节透光率T=100%。对于本身就有光吸收的物质,空白管的设计,一般只需用溶解待测物的溶剂即可,比如上述蛋白质测定实验中,标准蛋白溶液是水溶液,溶剂只有水,所以,用作空白管来扣除影响的就是纯水。

前面我们也学过,很多物质本身实际上并不具有光吸收,或者需要与试剂反应来增强吸光度,提高灵敏度,那这些通过发生化学反应生成有色物质来进行测定的实验设计上有什么不同吗?

首先,波长的选择,一般也是选择所生成的有光吸收的物质的最大光吸收波长。不过有时候我们也需要考虑残余的反应试剂带来的影响,如果反应试剂和产物的吸光度有重叠,则要考虑选择反应试剂影响比较小而产物光吸收又比较强的波长来进行测定,而不一定是产物的最大光吸收波长。

比如图中的反应物和产物,在产物吸光度最强的“波长1”处,反应物也有一定的光吸收,会对最后的测定和计算造成误差,这种情况下,就应该选择“波长2”进行产物的测定,尽可能排除反应物对吸光度的影响。

第二章 第五节 2 反应物产物光谱图.png


其次,关于吸光度范围的选择原则是一致的,尽量让吸光度落在0.2-0.8的范围内,需要注意的是,有些物质与反应物发生反应受到条件的限制,线性范围较窄,此时就应该选择产物与待测物浓度呈线性的吸光度范围设计实验,不一定非达到0.8。

此外,有些产物的生成需要一定的时间过程,或者所生成产物只在一定的时间内稳定存在,这时候就要在操作中严格控制操作时间。
 

第二章 第五节 4 反应时间图.png

第三,对照管的设计。对于需要发生反应才能生成有色物质的实验来说,对照管的设计出了要扣除溶剂影响以外,还要扣除反应物的影响,所以对照管中除了溶剂,还需要与其他测定管等量等比例加入所有反应试剂,也就是,除了你的待测物不加以外,其他试剂都按比例等量加入,而且保证和其他样品管反应条件完全一致,用这样的空白管调仪器透光率T=100%,就可以一次性扣除掉所有试剂带来的影响。比如我们用双缩脲试剂测定蛋白质浓度的实验中,标准曲线是这样设计的,用第一管作为空白管调透光率100%,就可以扣除掉比色杯、溶剂和双缩脲试剂等所有影响。

此外,有些特殊情况下,如果反应体系中有些物质光吸收比较强,会影响测定,还可以加入一定的掩蔽剂,让待测物之外的干扰物发生络合反应等,使其颜色不会影响测定,但是要注意,所有样品中加入的试剂必须保持一致。

还有一点要说明的是,分光光度法的测定只适用于均匀溶液,对于浑浊溶液来说,入射光会因散射损失,导致吸光度增加,标准曲线偏离线性。
所以务必要保证测定体系为均匀的溶液。

以上就是大家在设计分光光度法测定物质浓度的实验中需要考虑的主要几方面因素和注意事项,实际工作中可能还需要根据反应原理和特点进行调整,如果你在实践中遇到了问题,欢迎在论坛与大家讨论。




下一节:荧光分光光度计的原理和使用规范

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第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

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-第二节 本课程评分标准

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-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

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-第四节 生化实验室安全注意事项

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-第五节 本课程教学团队介绍

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-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

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-第二节 移液器的操作要点

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--正向移液和反向移液

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--移液器的日常校准

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--移液器的操作中易错点

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--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

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--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

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-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

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-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

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--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

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--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

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--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

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--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

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--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

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--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

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-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

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--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

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--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

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-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

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--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

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--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

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-第四章 酶活力的测定 作业

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-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

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--紫外分光光度法测定核酸

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

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--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

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--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

分光光度法测定物质浓度的实验设计笔记与讨论

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