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离子交换层析

依赖于带电性质进行蛋白质分离纯化的常见方法有等电点沉淀、离子交换层析和电泳。等电点沉淀已经在前面的视频中进行了介绍，电泳技术将在以后电泳部分进行专门的讲解，这里我将介绍离子交换层析技术。

在介绍离子交换层析技术之前，首先介绍柱层析（column chromatography），它是分离纯化蛋白质的有效技术。

柱层析系统由固定相和流动相组成。习惯上，人们将层析柱中的固相支持介质-柱填料称为固定相，将穿过支持介质的流动溶液称为流动相。

层析法也称色谱法，混合物中各组分由于其物理化学性质存在差异，它们在两相中的分布程度不同，在柱中的移动速度就不同，研究人员可以分部收集不同组分，从而达到获得目标组分的目的。

研究人员常常运用离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、吸附层析和疏水层析等等技术。

这里我首先向同学们介绍离子交换层析技术。

层析柱中的离子交换剂上具有可解离的基团，解离后的带电基团能够与待分离的混合物中带有与之相反电荷的各蛋白组分相结合，结合能力与各蛋白组分所带电荷相关。研究人员将待分离混合物加入层析柱中，混合物与交换剂进行结合、之后经过洗脱液洗脱，分部收集等过程可获得各蛋白组分，从而达到分离纯化蛋白质的目的，这种方法就是离子交换层析技术。

常见的分离纯化蛋白质的离子交换剂包括阴离子和阳离子交换剂两大类。

常见的离子交换剂有弱阴离子交换剂、强阴离子交换剂、弱阳离子交换和强阳离子交换剂，

阴离子交换剂二乙基氨基乙基纤维素，简称DEAE纤维素和季胺树脂Q。在一定pH范围内，它们能够解离出带负电荷的离子，之后自身带有正电荷，可以与带负电荷的蛋白组分结合阳离子交换剂羧甲基纤维素，简称CM纤维素和磺酸树脂S，在特定pH范围，它们可以解离出正电荷，而自身带负电荷，因此，可以与带正电荷的蛋白质组分结合。

以羧甲基纤维素CM-纤维素为例，它能够解离出带正电荷的离子，之后自身带有负电荷，可以与带正电荷的蛋白组分结合。

由于DEAE-纤维素和CM-纤维素所带的功能基团分别能够在pH大于10时或者pH＜4时，才能发生解离，所以两者为被称为弱阴、阳离子交换剂；而Q和S在水溶液中几乎一直保持解离状态，所以被称为强的阴、阳离子交换剂。

例如，采用阳离子交换剂分离含有三种蛋白质的混合物。当混合物溶液pH值小于三种蛋白质的等电点，此时所有蛋白质带正电荷。

首先将混合物样品加入层析柱，由于层析柱填料是阳离子交换剂，解离后带负电，它可以和三种带正电荷的蛋白质都结合，但是依据蛋白质带电荷性质不同结合强弱不同。

红色表示的蛋白质带正电荷最少，蓝色表示的蛋白质带正电荷最多，紫色代表的蛋白质带电荷居中。

将样品加入到层析柱中，三种蛋白质由于带有正电荷，都能够与层析柱中的离子交换介质结合。先采用低盐浓度洗脱液进行洗脱，由于盐离子和蛋白质竞争性地结合离子交换剂，所以在洗脱过程中，与离子交换剂结合最松弛的蛋白组分——红色表示的蛋白组分被盐离子置换出来，先被洗脱下来；蛋白组分由于带电荷性质不同，导致其与离子交换剂结合能力不同，因而在洗脱时，它们在柱中的下移速度不同，因而渐渐分开，结合能力最强的蓝色蛋白组分走得最慢。最后通过增加盐的浓度可将与离子交换剂结合最强的蓝色蛋白质也洗脱下来。

考虑到蛋白质在不同pH值溶液中带电情况不同，可知不同pH条件下，混合物中各蛋白组分与离子交换剂结合紧密程度也不同。因此，也可以通过调节洗脱液的pH值对混合物进行洗脱，以期达到分离的目的。很多情况下，研究人员常同时考虑盐浓度和pH值，采用两者的不同组合进行洗脱，以期达到更好的分离效果。

通常情况下，蛋白质并不带有颜色，那人们是如何获知蛋白质从层析柱中流出与否呢？记得之前曾了解了蛋白质具有280nm紫外吸收特性吗？对了，可以利用紫外检测仪来检测蛋白质是否出现。当蛋白质出现时，在紫外检测仪上会出现洗脱峰。

纵坐标表示蛋白含量，横坐标表示洗脱体积。所谓的洗脱体积是指从洗脱开始，到某蛋白质出现达到浓度最高值时所使用的洗脱液的体积（Ve）。

离子交换层析在蛋白质分离纯化过程中，常常是在精细分离时使用。请看下面的案例。

这是鸡卵粘蛋白分离纯化过程中的一个步骤。该蛋白前期通过丙酮沉淀粗分离、再进行细分级分离时采用了离子交换层析技术，填料是阴离子交换纤维素DEAE。


下一节:亲和层析

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基础生物化学实验课程列表：

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么？

--《生物化学实验》学什么？

--《生物化学实验》学什么？

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习？

--不同需求的同学如何学习本课程？

--不同需求的同学如何学习本课程？

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素（VB2）荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗？

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

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-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶比活力的测定（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力的计算（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力的计算（Folin酚法）

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶，想想怎么测？

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

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--拟南芥叶片基因组DNA提取

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--紫外分光光度法测定核酸

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子，如何纯化呢？

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳，还有什么用于生物大分子鉴定的方法？

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

离子交换层析笔记与讨论

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