当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第六章 利用电泳对生物大分子进行检测 > 第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳 > 核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析
同学们好
今天我们来学习和酸琼脂糖凝胶
电泳的染色及结果分析
经过琼脂糖凝胶电泳分离的DNA
我们肉眼看不到条带的位置
需要通过染色法检测和观察
分析样品的大小和纯度
可以采用凝胶内染色
也称为胶染法或电泳后
染色即泡染法观察
凝胶内染色是在电泳前制备凝胶时
将染料按一定比例加入
电泳后染色是在电泳结束后
将凝胶浸泡在含有染料的溶液中染色
这张表中总结了两种
方法的优点和缺点
凝胶内染色更方便
染料用量少
但是因为带正电的染料与
核酸的迁移方向相反
会影响低分子量样品的检测
特别是在长时间运行的情况下
此外与核酸结合的染料
会改变样品的迁移率
导致检测到样品的大小
与实际大小有差别
电泳后染色不影响样品的检测
是准确测定样品大小的首选方法
但是电泳后染色所需时间较长
染色液用量大
会产生更多的有害废物
了解了染色方法
现在我们来认识几种常见的核酸染料
有的是非荧光染料
有的是荧光染料
非荧光染料是与DNA通过离子
键结合来显示DNA的位置的
非荧光染料的灵敏度不如荧光类染料
但是非荧光类染料不需要紫外光激发
能够减少对DNA的破坏
常见的非荧光染料有噻嗪类染料
比如亚甲基蓝
除此之外含有尼罗蓝类染料
荧光染料与DNA结合后
可在某一波长的紫外光照射下观察
灵敏度比较高
荧光染料和非荧光染料各有优劣
我们可以根据实验的目的
和实验条件进行选择
目前实验室琼脂糖凝胶电泳结果的
观察中常用的是核酸的荧光染料
荧光染料有很多种类
这里我们以溴化乙锭和新型荧光
染料Gel-red为例进行介绍
实验室最常用最便宜的DNA染色液
使溴化乙锭简称为EB
这是溴化乙锭的结构式
溴化乙锭中的乙锭基团
可以嵌入到第一分子的碱基对之间
形成荧光络合物
紫外光照射后
DNA所在处发出橙黄色的光
因此我们可以观察到DNA的条带
溴化乙锭可以在电泳前制备
琼脂糖凝胶的过程中加入
通常将溴化乙锭配成10毫克
每毫升的储存液浓度
加入凝胶中的推荐浓度
是0.5微克每毫升
或者是在电泳结束后
将凝胶放入含有0.5微克每毫升
溴化乙锭的水或缓冲液中
染色30~45分钟
溴化乙锭可以检测到
少至10ng的DNA
需要注意的是溴化乙锭是
潜在的可致癌诱变剂
同学们在使用时一定要注意防护
避免直接接触皮肤
为了更安全高效的检测核酸条带
陆续开发出很多新型的荧光染料
Gel-red就是其中的一种
这是它的结构式
Gel-red有很好的稳定性
灵敏度和安全性
它的挥发性低
分子极性不强
难以穿透进入到细胞膜内
但是Gel-red并不是完全没有毒性
同学们使用时还是要注意防护
小心操作
通过核酸的琼脂糖凝胶
电泳和染色
我们就可以分离
并观察到分子量大小不同的DNA片段
如何确定待测DNA片段的大小
对于线性双链DNA片段来说
在一定范围内定义的迁移距离
与分子量的对数成反比
我们可以在电泳时将一系列
分子量已知的核酸样品
即分子量标准
与待测样品在同一块胶上进行电泳
比较分子量标准与待
测样品的迁移距离
从而可以推断待测样品的分子量大小
下面我们以这张实际的
电泳图谱为例进行分析
最左侧这列是分子量标准
它的各条条带的大小
如图中所示
待测样品是PCR的产物
预计大小是170bp
电泳后条带的位置位于200bp和
100bp之间更接近200bp
因此我们可以初步判断
这是我们的目的条带
后续可以通过测序等方法
进行进一步的鉴定
此外
因为分子量标准中每一条
条带的含量是已知的
通过比较待测样品条带亮度
与分子量标准条带的亮度
还可以判断样品中的DNA的浓度
本节课中我们了解了琼脂糖凝胶
电泳的荧光
染料
溴化乙锭以及新型核酸染料
Gel-red的染色原理和特点
同时也学习了核酸琼脂糖凝胶
电泳后的结果分析的方法
同学们在实验过程中选择了什么
核酸染料
有没有遇到什么问题
可以在讨论区和我们展开讨论
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试