当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > IMAC亲和层析技术的基本步骤
之前,我讲解了固定化金属离子亲和层析IMAC技术的原理,现在我将向大家介绍这项技术的基本操作步骤。
在实际工作当中,用Ni亲和柱分离纯化多聚组氨酸标记融合蛋白质的技术很常用。
图片显示的是购买的商品化的IMAC柱填料,这种填料是前面提到的凝胶和配基偶联的介质Sepharose, 该产品是GE Healthcare 公司生产的Chelating Sepharose Fast Flow系列产品之一。
利用IMAC技术分离纯化多聚组氨酸标记融合蛋白包括以下几个过程:亲和柱制备、平衡、上样、清洗未结合亲和柱的蛋白质、洗脱目标蛋白、亲和柱的再生等等。
让我们首先看看装柱:
层析柱的几个部分,是层析柱下面的盖子、柱体以及柱底部的垫片。在实验室中,常常选择1mL的层析柱装柱。商品填料是用20%乙醇浸泡的凝胶,使用时,摇匀,用移液器吸取1mL,加入到去离子水冲洗过、加了垫片的柱中。在重力的作用下,凝胶颗粒自然下沉,形成均匀的柱床。
用至少2倍体积的去离子水清洗层析柱;
之后,将 1M的 NiSO4 1mL加入到柱中,收集流出的溶液重新加入柱中,重复3次, 以保证足够的镍离子与柱介质结合;之后继续向柱中加入10mL去离子水,清洗没有与柱介质结合的多余的镍离子。蓝色的部分就是结合了镍离子的柱凝胶。
装柱完成后,需要平衡柱子,以达到与即将上样样品相同的缓冲体系。加入10 mL平衡缓冲液充分平衡柱床。待缓冲液全部进入柱床后,盖上柱下面管口的盖子,停止平衡过程。
平衡完成后,开始上样,用移液器将蛋白质样品溶液缓慢沿壁加入柱中。
值得强调的是样品的制备环节,注意在含有样品的溶液中,尽可能保持没有乙二胺四乙酸,也就是没有EDTA,没有柠檬酸,没有高浓度的具有竞争性结合的一级铵、咪唑/组氨酸等,以免影响样品与柱介质上金属离子的结合。
加样完毕后开始清洗:在柱中加入10 mL清洗缓冲液,洗脱去除不与柱介质紧密结合的各种蛋白,收集流出的液体,标记为杂蛋白。待缓冲液全部进入柱床后,盖上盖子,停止清洗。
杂蛋白清洗完毕后,在柱中加入10 mL洗脱缓冲液,将目表蛋白从柱介质上洗脱下来,在柱下端收集洗脱液,标记为目标蛋白。待缓冲液全部进入柱床后,盖上盖子,停止洗脱。
获得目标蛋白后, 需要对镍柱进行后处理: 通常情况下是向柱中加入10 mL 含500 mM 咪唑的缓冲液,彻底清洗柱介质上结合的蛋白,待缓冲液全部进入柱床后,再用10 mL去离子水继续洗脱,洗脱结束后,再加入去离子水覆盖柱介质,将柱下部管口的盖子盖好, 4℃保存,以备下次使用。
那同学们现在是否又有疑惑了,为什么后处理柱子,要加含有500 mM 咪唑的缓冲液呢?
记得前面我曾谈到过,亲和层析技术中常见目标蛋白洗脱方式主要包括两种:一种是通过改变洗脱液的pH值、离子强度或者缓冲液组成来洗脱结合在柱介质上的目标蛋白。另一种是用含有高浓度配基的洗脱溶液洗脱结合在柱介质上的目标蛋白。
这里就是利用了第二种方式,此时的咪唑就相当于配基。通常用于目标蛋白洗脱缓冲液中的咪唑浓度是300mM, 而再生柱时, 用的缓冲液中咪唑浓度是500mM。如此操作的目的是通过增加咪唑的浓度, 以便更好地,彻底洗脱结合在柱介质上的蛋白质。
此时,你是不是还有疑惑,感觉镍柱后处理过于简单呢?你的疑惑是有道理。其实用镍柱分离纯化不同类型的蛋白,柱的再生方法也不同,你可以依据所分离的蛋白特点,查阅相关资料进行柱的再生,这里就不再赘述啦。
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