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IMAC亲和层析技术的基本步骤

之前,我讲解了固定化金属离子亲和层析IMAC技术的原理,现在我将向大家介绍这项技术的基本操作步骤。

在实际工作当中,用Ni亲和柱分离纯化多聚组氨酸标记融合蛋白质的技术很常用。

图片显示的是购买的商品化的IMAC柱填料,这种填料是前面提到的凝胶和配基偶联的介质Sepharose, 该产品是GE Healthcare 公司生产的Chelating Sepharose Fast Flow系列产品之一。

利用IMAC技术分离纯化多聚组氨酸标记融合蛋白包括以下几个过程:亲和柱制备、平衡、上样、清洗未结合亲和柱的蛋白质、洗脱目标蛋白、亲和柱的再生等等。

让我们首先看看装柱:

层析柱的几个部分,是层析柱下面的盖子、柱体以及柱底部的垫片。在实验室中,常常选择1mL的层析柱装柱。商品填料是用20%乙醇浸泡的凝胶,使用时,摇匀,用移液器吸取1mL,加入到去离子水冲洗过、加了垫片的柱中。在重力的作用下,凝胶颗粒自然下沉,形成均匀的柱床。

用至少2倍体积的去离子水清洗层析柱;

之后,将 1M的 NiSO4  1mL加入到柱中,收集流出的溶液重新加入柱中,重复3次, 以保证足够的镍离子与柱介质结合;之后继续向柱中加入10mL去离子水,清洗没有与柱介质结合的多余的镍离子。蓝色的部分就是结合了镍离子的柱凝胶。

装柱完成后,需要平衡柱子,以达到与即将上样样品相同的缓冲体系。加入10 mL平衡缓冲液充分平衡柱床。待缓冲液全部进入柱床后,盖上柱下面管口的盖子,停止平衡过程。

平衡完成后,开始上样,用移液器将蛋白质样品溶液缓慢沿壁加入柱中。

值得强调的是样品的制备环节,注意在含有样品的溶液中,尽可能保持没有乙二胺四乙酸,也就是没有EDTA,没有柠檬酸,没有高浓度的具有竞争性结合的一级铵、咪唑/组氨酸等,以免影响样品与柱介质上金属离子的结合。

加样完毕后开始清洗:在柱中加入10 mL清洗缓冲液,洗脱去除不与柱介质紧密结合的各种蛋白,收集流出的液体,标记为杂蛋白。待缓冲液全部进入柱床后,盖上盖子,停止清洗。

杂蛋白清洗完毕后,在柱中加入10 mL洗脱缓冲液,将目表蛋白从柱介质上洗脱下来,在柱下端收集洗脱液,标记为目标蛋白。待缓冲液全部进入柱床后,盖上盖子,停止洗脱。

 

获得目标蛋白后, 需要对镍柱进行后处理: 通常情况下是向柱中加入10 mL 含500 mM 咪唑的缓冲液,彻底清洗柱介质上结合的蛋白,待缓冲液全部进入柱床后,再用10 mL去离子水继续洗脱,洗脱结束后,再加入去离子水覆盖柱介质,将柱下部管口的盖子盖好, 4℃保存,以备下次使用。

那同学们现在是否又有疑惑了,为什么后处理柱子,要加含有500 mM 咪唑的缓冲液呢?

记得前面我曾谈到过,亲和层析技术中常见目标蛋白洗脱方式主要包括两种:一种是通过改变洗脱液的pH值、离子强度或者缓冲液组成来洗脱结合在柱介质上的目标蛋白。另一种是用含有高浓度配基的洗脱溶液洗脱结合在柱介质上的目标蛋白。

这里就是利用了第二种方式,此时的咪唑就相当于配基。通常用于目标蛋白洗脱缓冲液中的咪唑浓度是300mM, 而再生柱时, 用的缓冲液中咪唑浓度是500mM。如此操作的目的是通过增加咪唑的浓度, 以便更好地,彻底洗脱结合在柱介质上的蛋白质。

此时,你是不是还有疑惑,感觉镍柱后处理过于简单呢?你的疑惑是有道理。其实用镍柱分离纯化不同类型的蛋白,柱的再生方法也不同,你可以依据所分离的蛋白特点,查阅相关资料进行柱的再生,这里就不再赘述啦。


下一节:核酸的制备原理及基本步骤

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第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

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-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

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--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

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--拟南芥叶片基因组DNA提取

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--紫外分光光度法测定核酸

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

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--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

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--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

IMAC亲和层析技术的基本步骤笔记与讨论

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