当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > 凝胶过滤层析的操作过程和注意事项
凝胶过滤层析进行物质分离时,主要依据于蛋白质分子的大小,因此并不像离子交换层析、亲和层析那样专一性较强。因此,如何操作才能保证好的分离效果就显得尤为重要。
凝胶过滤层析技术的操作流程包括:
凝胶选择、凝胶的预处理、装柱、平衡、上样、洗脱以及凝胶柱的后期处理等多个过程。关于凝胶的选择在上一个视频中进行了简单介绍,这个视频我从凝胶的预处理开始讲解。
第一:先看凝胶的预处理
商品凝胶中颗粒是干胶,而且凝胶颗粒也不完全均匀,使用前需要清除破碎的凝胶颗粒,并需要使胶溶胀。因此,通过用洗脱液浸泡,或者沸水浴1~2小时处理。在溶胀过程中禁止剧烈搅拌,以免凝胶颗粒破裂。
凝胶溶胀后静置放置,在烧杯中可分为两部分。正常完好颗粒的凝胶位于烧杯的下部分。烧杯液体表面漂浮着一层凝胶颗粒,这些是破损的颗粒,要倾倒出去,保留完好凝胶颗粒准备装柱。
装柱时首先在层析柱中加入1/3柱高度的洗脱液;之后在搅拌的条件下,将溶胀好的凝胶颗粒缓慢、连续加入层析柱;当层析柱底面自然沉降的凝胶颗粒达到1~2cm高度时,打开层析柱下面出口的夹子,让洗脱液自然流出,同时继续搅拌加入剩余的凝胶溶液;当自然沉降的凝胶颗粒积累到离层析柱顶部3~5cm处时,关闭层析柱底部出口外面的夹子,停止装柱。
现在让我们一起看看平衡过程
装柱完毕后,需要用3 ~5个柱床体积洗脱液继续加入层析柱平衡洗脱。注意层析柱有凝胶颗粒的部分不能出现气泡和断层,柱中凝胶颗粒上表面不能呈现凹凸不平。
谈到层析柱床体积,我需要介绍四个概念 外水体积、内水体积、柱床体积和洗脱体积。
内水体积是指凝胶颗粒中孔道所容纳的洗脱液的体积,用Vi表示。
外水体积是指层析柱中凝胶颗粒之间空隙所容纳洗脱液的体积用Vo表示。
凝胶颗粒本身也有一定的体积,用V g表示。
柱床体积是上述三个体积之和
洗脱体积: 是指从加入样品开始 直至某蛋白组分最大浓度出现时所流出的洗脱液体积,用Ve表示。
上样时,凝胶表面要平整,用吸管吸去凝胶颗粒表面的洗脱液,打开层析柱下面的夹子,让多余的洗脱液流出,待层析柱凝胶上表面洗脱液刚好全部进入凝胶时,关闭层析柱下面的开关。缓慢加入样品,打开层析柱下面的开关,待样品刚好全部进入层析柱时,关闭层析柱下面的开关。再沿层析柱管壁加入少量洗脱液清洗管壁上的样品,打开层析柱下面的开关,待样品再次全部进入层析柱时,缓慢加入洗脱液,洗脱液要高于层析柱凝胶上表面约3cm左右,开始洗脱。
如果上样时,凝胶颗粒表面呈现凹凸不平,则需要用玻璃棒轻轻搅动凝胶表面,待凝胶颗粒重新自然沉降形成平整的凝胶平面后再加样。
现在进行到洗脱与样品收集的步骤了。
将层析柱下面的塑料细管与恒流泵相连,从恒流泵出来的塑料细管与紫外检测仪相连,之后连接紫外检测仪与部分收集器。用洗脱液进行洗脱,根据紫外检测仪显示结果进行样品组分收集。部分收集器中每管收集液体1~2mL。
最后是凝胶柱的后处理:为了防止凝胶层析柱被细菌侵染,在短期不使用的情况下需要加入抑菌剂。例如,可以加入0.02%的叠氮化钠,或者0.01%~0.02%的三氯丁醇。在凝胶柱长期不使用的情况下,也可以经过处理,将溶胶处理形成干胶,进行保存。
凝胶过滤层析的分离效果会受到哪些因素的影响呢?
层析柱的长度和粗细对分离效果有很大的影响。柱子越长,分离效果越好。但是,增加柱长,也会增加样品的稀释度,降低流速;在相同长度下,柱子越粗,管壁效应越小,分辨率会相对越好。
通常情况下,柱长度/柱直径比值为(25~100):1,比值越高,分离效果越好。由于流速、柱子灌注均匀性等问题,一般层析柱长度不超过1m。如果脱盐操作,分辨率要求不高,可选择较短的柱子。
上样样品体积对分离效果也有很大的影响
加样体积越小,分离效果越好。上样量一般控制在:分析型 上样量是床体积的1%~ 4%
而制备型 上样量是床体积的25%~30%
洗脱液流速也是影响因素之一:
实验时,最好使用恒流泵,以维持流速恒定。否则,对于机械强度较低的凝胶 ,就会产生凝胶被压紧而使柱床堵塞的现象。
最后,我们来谈谈Sephadex G-25
该层析凝胶的分离范围是相对分子量1000~5000之间。用途是除盐,就是将小分子和大分子物质分离开来。
记得之前谈到过盐析。假如通过盐析,我们获得了含有目标蛋白质的蛋白样品混合物,当要继续进行下一步的分离步骤时,样品中的硫酸铵将会对后续操作产生影响,为此需要去除样品中的硫酸铵小分子,这个过程被称作除盐。除盐的过程可以通过透析或者Sephadex G-25层析柱完成。
让我们一起看看如何除盐吧。
一般情况下蛋白质相对分子量都大于5000,而硫酸铵的分子量仅有132.14。
将硫酸铵分子比作红色小球,由于它分子量小,可以任意进入凝胶颗粒。蛋白质分子比作绿色小球和黄色小球,由于分子量大,无法进入凝胶颗粒,而直接被洗脱下来。收集先被洗脱出来的蛋白部分,如此就能达到除盐的目的
有关Sephadex G-25除盐的知识点曾两次被作为全国研究生入学统一考试农学门类联考题,分别出现在2009年和2012年。题目如下:
2009年的题目是:酶纯化实验中,通常先用(NH4)2SO4作为分级沉淀剂,再用Sephadex G-25凝胶柱层析法从沉淀酶液中除去(NH4)2SO4。请问:
(1) 与其他中性盐沉淀剂相比,用(NH4)2SO4做沉淀剂有何优点?
(2) 如发现柱层析后 酶的总活性较纯化前明显升高,可能的原因是什么?
(3) 柱层析时,湿法装柱的注意事项主要有哪些?
2012年的题目:用葡聚糖凝胶G-25分子筛层析去除蛋白质溶液中硫酸铵的实验原理是什么?还可以用哪一种实验方法达到同样实验目的?(写出方法的名称即可)
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-第二节 移液器的操作要点
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--移液器的日常校准
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