当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第四章 酶活力的测定 > 第二节 菠萝蛋白酶活力的测定 > 菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)
我们在经过酶反应和酪氨酸测定之后
就会得到一系列680纳米
波长下的吸光度值
并且通过Bradford法测定了
菠萝蛋白酶溶液中的蛋白质浓度
也得到了一系列的吸光度值
接下来我们一起来看看如何利用这些
数据来计算菠萝蛋白酶的比活力
首先我们需要计算出0.5毫升
标准曲线体系中的酪氨酸浓度
以酪氨酸的浓度为横坐标
以680纳米的吸光度值为纵
坐标来绘制酪氨酸标准曲线
计算三支酶测定管的吸光度值
的平均值得到0.475
将测定管的吸光度值减去
对照管的吸光度值
等于0.425
然后通过拟合方程计算吸光度值对应的
酪氨酸浓度酶促反应时间中生成的酪氨酸
浓度就等于0.0618毫克每毫升
这就是酶促反应时间10分钟内
生成的酪氨酸在体系中的浓度
所以我们用浓度乘以体系的体积
就可以知道体系中有多少微克的酪氨酸
那么这个体系的体积应该是多少呢
我们来回顾一下酶学部分的实验过程
每管体系中含有0.5毫升的缓冲液
0.5毫升的酶液
一毫升的酪蛋白溶液和一毫升的
三氯乙酸溶液总共是三毫升
这里同学们可能会问
为什么要加上三氯乙酸呢
这时候不是没有酶反应了
为什么不应该只包含缓冲
液酶和酪蛋白溶液呢
请注意
各位同学在做酶学计算的时候
一定要注意区分反应体系和测定体系
我们测定的酪氨酸浓度是在加入
三氯乙酸之后的上清中
所以此时的浓度应该是加入三氯乙酸
之后的三毫升体系中的浓度
我们用浓度乘以3毫升的体积
就可以知道体系中生成
了多少微克的酪氨酸
也就是0.0618毫克每毫升乘以
3毫升等于0.185毫克
也就是185微克
到此为止
我们就计算出了10分钟酶反应时间
中总共生成了185微克的酪氨酸
而我们对菠萝蛋白酶活力的规定是
每分钟水解酪蛋白生成一微克酪氨酸
的酶量为一个酶活力单位
因此每管反应体系中的酶活力单位
就等于酪氨酸的量除以10分钟
也就是185÷10
就是18.5个U
这些活力单位是我们在测定过程中加入
体系的0.5毫升酶液中的活力单位
所以可以计算出每毫升
酶液中的活力单位数
也就是18.5U÷0.5毫升
等于37U每毫升
这就是酶液中的活力单位
接下来我们继续计算菠萝蛋白酶的比活力
这需要测定和计算此溶液中的蛋白质浓度
我们采用的是Bradford法
以下是实验数据
我们同样需要先计算一系列
标准曲线的蛋白质浓度
然后以蛋白质浓度为横坐标
以595纳米的吸光度值
为纵坐标绘制标准曲线
计算三只样品管的吸光度
的平均值0.349
通过拟合方程计算样品管中蛋白质的浓度
就得到0.13毫克每毫升
也就是说这份酶溶液它的蛋白质
浓度是0.13毫克每毫升
最后一步计算菠萝蛋白酶的比活力
比活力的单位是每毫克蛋白
中含有的活力单位数
所以我们用前面计算出的酶液中
的酶活力含量37U每毫升
除以蛋白质浓度0.13毫克每毫升
也就等于284.615U每毫克
这就是酶活力和比活力的计算方法
同学们在实际计算过程中
注意思考
每一步计算的意义掌握
酶活力测定和计算的思路
就可以顺利的完成所有
酶活力的测定实验了
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