当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第四章 酶活力的测定 > 第一节 酶活力测定的常用方法 > 酶活力测定的常用方法
作为任何一个生物体新陈代谢都必不可少的催化剂,对于生物酶功能的研究从未停止,而且随着新技术的不断涌现和研究手段的逐步更新,关于生物酶的功能研究也越来越深入,不断刷新着人类对生命本质的认识。
同时,一大批酶已成为现代研究技术的工具,比如限制性内切酶、连接酶用于基因重组操作,胰蛋白酶用于细胞培养操作等等,他们早已成为科研中必不可少的工具。
在研究中,人们还发现,许多酶可以作为疾病治疗的靶点,如逆转录酶抑制剂可用于治疗HIV感染,端粒酶则成为肿瘤治疗的靶点之一。
此外,酶还与我们每个人的健康和生活息息相关,比如我们生病去医院,医生要求化验血液和尿液,有时就是要检测我们机体中酶活力的变化,指导医生正确判断病情。
如果一个人血液中转氨酶的活力大幅度上升,那么,这个人很有可能是换上了肝脏疾病或心脏疾病,如果一个人血液或尿液中淀粉酶的活力大幅度上升,则非常有可能是急性胰腺炎或流行性腮腺炎,配合其他相关检查,就可以让医生了解我们的身体是哪里出了问题,该如何治疗,另一方面,这些指标的监测,还可以提示医生疾病的治愈程度。
生了病需要吃药,很多药物也是酶制剂或利用酶来生产的,比如消化不良,可以吃些蛋白酶帮助分解蛋白助消化,尿激酶可以溶解血栓治疗心脑血管疾病,青霉素酰化酶用于制备头孢霉素,β-酪氨酸酶用于生产多巴等。
除了医药领域,我们生活中常用的大量的工业制品,其生产过程都离不开酶的参与,比如在食品加工业,我们利用淀粉酶来水解淀粉制糖,利用木瓜蛋白酶适度水解蛋白纤维,使肉类口感更嫩,利用葡萄糖氧化酶防止啤酒氧化,保持风味,利用溶菌酶则可以防止细菌滋生。
除了吃的食品,我们穿的衣服,很多是使用淀粉酶完成退浆,纤维素酶的处理可以让棉织物手感更加舒适,适度的蛋白酶处理,可以让我们的毛衣不易毡化缩水,我们日常所使用的纸张,也可用漆酶分解木素达到漂白的目的。
说了这么多酶的重要作用,大家就明白为什么那么多科学家都在研究酶,而那么多工厂都在生产酶了吧。无论是研究酶还是生产酶,我们都会面临一个首要问题,就是酶的定量,也就是我们该如何衡量酶的多少,如何测定酶呢?
我们在分析化学课程中,学过很多物质的定量测定,基本上,绝大多数物质的定量,都可以用浓度或者质量的单位来衡量,比如,我获得了一份蛋白冻干粉,它的质量是1.5g,这是明确的定量,又比如说,我得到一份核酸溶液,它的浓度是1mg/ml,这也是明确定量,那么酶是不是也可以如此简单的用质量和浓度来定量呢?
我们都知道,绝大多数酶的本质都是有催化活性蛋白质,但对一个酶制剂来说,蛋白浓度高就一定代表可以催化更多的底物分子转换成产物吗?显然不是!因为制剂中的部分酶分子可能会失活,所以,单纯测定蛋白浓度是无法体现这份酶制剂的活力高低的,换句话说,就算我们可以保证这份酶制剂里都是纯的酶蛋白,也无法知道其中多大比例的酶蛋白是有活力,多少是没有活力的,比如这两份酶制剂,你会选择哪一份呢?蛋白多的?还是蛋白少的?
因此,要评价一份酶制剂的质量,我们必须要知道的是这份酶制剂可以干多少活,而不是有多少个蛋白分子!这个评价指标就是酶活力单位。
上世纪60年代前,酶活力单位的定义多以建立方法的科学家名字命名,比如测定转氨酶的单位有金氏法使用的金氏单位,穆氏法使用的穆氏单位等。结果同一种酶也会同时使用多种单位,给实际工作带来不便。
为了便于标准化比较,1963年国际生化协会酶学委员会推荐采用国际单位(IU)来统一表示酶活性的大小。将酶活性单位定义为:在特定的条件下,1 min催化1 μmol底物转化的酶量,所以1 IU=1 μmol/min。有些实验室会省略掉国际一词,即将IU简写为U。不过,实际工作中为了计算和比较的方便,有些酶还是会延续使用自定义的活力单位。
明确了酶活力单位的定义,接下来我们要思考的就是实际工作中,到底该如何设计实验来精确的测定酶催化反应的速度呢?
首先,酶活力的测定一般要在最适反应条件下,也就是首先要提供给酶最适温度、最适pH值和最适离子强度,确保酶可以最大限度的发挥其功能!
但是实际操作中,有些酶的最适反应温度很高,但是高温下又容易失活,所以实际测定中会考虑酶的半衰期,选择37-40℃之间进行测定,而不一定都在酶活力最高的温度。
有了合适的环境,我们还要做到一点,就是要保证我们测的是反应的初速度,因为随着反应的进行,酶活力可能会受到体系变化、底物减少和产物堆积等复杂因素的影响,所以尽可能测定反应初期的初速度。
要保证初速度常采用的手段无外乎两个,一是控制反应时间,在比较短的时间内完成测定,另一个就是增加底物浓度,确保底物大过量,不会限制酶的工作效率。
确定了最适反应条件和初速度,接下来我们要做的就是搞清楚酶到底转化了多少底物变成产物!
要知道这一点,我们需要做的就是检测底物的减少量或者产物的增加量,可是无论底物的减少还是产物的增加,显然都不是肉眼可见,我们必须建立对底物或产物有效可信的测定方法,实际上我认为这才是一个酶活力测定实验中最核心的部分。而实际工作中,因为底物往往大过量,因此对底物减少的测定可能准确度不高,人们会尽量采用测定产物增加的方法。为了便于说明和比较,我们本次课就依照对底物和产物测定方法的不同,大致分为三类来介绍。
让我们先从最简单的开始:当待测定物质直接就可以产生明确的可检测信号,比如,有颜色,也就是在可见光下有光吸收;或者有紫外光吸收,又或者能发出荧光,又或者可检测同位素剂量,当然最常用最方便而且最便宜的还是直接测紫外或可见光吸收。
举个例子说吧,如果我们要测定细胞色素c氧化酶,可以使用还原型细胞色素c作为底物,经细胞色素c氧化酶催化,生成氧化型细胞色素c,其中还原型细胞色素c在560nm处有光吸收,而生成的氧化型细胞色素c并没有光吸收,由此就可以通过连续监测560nm光吸收的变化来计算底物减少的量,进而推算酶的活力。
可是,绝大多数情况下我们并没有这么幸运,大多数酶的底物和产物分子都没有可以很方便的直接测定的光吸收,也可以说没有明确的可检测信号,那我们能想到最直接的解决思路就是让没有检测信号的分子变成可检测的衍生物。比如,当我们要测定碱性磷酸酶的时候,可以用α-磷酸萘酚作为底物,通过碱性磷酸酶的催化水解掉一分子磷酸,生成α-萘酚,虽然α-萘酚没有光吸收,但是可以马上与体系中的偶氮试剂反应生成405nm处有光吸收的重氮色素,然后通过分光光度计检测405nm处光吸收的增加,从而推算出α-萘酚的生成速度,进一步计算出酶活力。
通过一步反应生成有光吸收物质的方法相比直接法稍稍复杂一点,设计实验时要确保所有的酶反应直接产物都可以快速的反应生成可检测的物质。
总的来说,直接测定和间接测定的方法都不复杂,可是非常不幸,有些酶催化的反应既不能生成直接可检测的物质也没有合适的方法可以发生快速的化学反应生成可检测的物质,这可怎么办?
遇到这种情况还可以看看这个新生成的产物有没有可能通过其他的酶催化,得到可检测的信号呢?如果可以,可将俩个酶学反应偶联,得到可检测的产物,通过检测第二个反应的产物,推算出第一个反应的产物量,进而计算酶活力。
听起来有点儿复杂,我们不如来看个例子。比如己糖激酶,它可以催化葡萄糖生产6-磷酸葡萄糖,可不幸的是无论葡萄糖还是6-磷酸葡萄糖都没有光吸收,也无法很方便的通过一个化学反应生成有光吸收的物质,怎么办呢?有人发现另一个酶——6-磷酸葡萄糖脱氢酶可以催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖内酯,虽然这个内酯也没有光吸收,但是反应过程中会同时催化等mol的NADP生成NADPH,大家都知道NADPH可是在340nm处有光吸收的呀,因此就可以通过检测340nm处光吸收的增加来推测生成6-磷酸葡萄糖的速度,进而计算己糖激酶的活力。
说到这里,你有没有想过这类俩个酶反应偶联的方法在实际应用中应该注意什么呢?
一定要记住,你要测定的是第一个酶,而第二个酶反应只是不得已为之,要尽可能降低它的存在感!也就是一定要确保第一个酶是限速步骤。要做到这一点,选择第二个偶联反应的时候,从反应原理上要确保第一个反应的产物可以立即与第二个酶发生反应,生成最终产物。同时为了保证第二个反应不会成为限速步骤,还要多加一点催化第二个反应的酶,让它过量,瞬间把第一个反应生成的产物都反应掉。最后还要提醒的是,选择偶联反应的时候可不能只看反应方程式,一定要选择与第一个酶最适条件接近的酶来催化第二个反应,不然,第二个酶可不会好好干活。
以上,是关于酶活力测定实验设计的基本思路,接下来,我们将以具体的酶活力测定实验原理和操作为例,学习和体会酶活力测定实验的设计思路和操作注意事项。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试