当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第一节 蛋白质的定量测定 > Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法
身为生命科学专业的学生,你知道全世界被引用最多的论文是讲什么的吗?
2014年,著名科学杂志《Nature》提出了这个问题并请拥有SCI的汤森路透列出从1900年至今公开发表的被引用量最高的100篇论文。
论文涵盖生物学、数学、物理、化学、医学、心理学等学科。
其中引用率最高的6篇论文均为生物学科的论文,而排名第一的一篇已经被引用超过30万次。
这是一篇于1951年发表在生物化学杂志JBC上的关于蛋白质测定的科研论文。那么,是什么样的论文如此受到全球科学家的青睐呢?
这篇论文讲的就是我们今天要做的实验《Lowry法测定蛋白质浓度》,这个方法得名于其作者oliver Lowry。下面,让我们一起看看这个方法到底是怎么回事吧。
Lowry法测定蛋白质浓度的方法是利用一种特殊的试剂与蛋白质发生反应生成蓝色物质,蓝色物质的量与溶液中蛋白质的浓度成正比,
这种试剂的名字叫做Folin-Ciocalteu试剂,一般翻译为福林-乔卡梯奥试剂(简称FCR),也就是我们常说的福林酚试剂,在有些文献中也称为或福林-丹尼斯试剂(Folin–Denis reagent)
这些名称来自于与此试剂建立有关的三位科学家Otto Folin, Vintilă Ciocâlteu和Willey Glover Denis。
这个试剂主要成分是磷钨酸和磷钼酸,配制方法较为复杂,一般直接从试剂公司购置。早在1927年,此试剂就被用来测定酪氨酸含量,以及在食品等行业用于测定植物产品中的酚含量。
1951年,生物化学家Oliver H. Lowry改进前人方法,建立了用福林酚试剂测定蛋白质浓度的方法,并在JBC生物化学杂志上发表了题为《Folin酚法测定蛋白质的浓度》的科研论文,所以此测定方法常被称为Lowry法或Folin酚法。
此法一出,因其灵敏度高、显色稳定等优点立即成为实验室最常用的测定方法之一,所以已经累计被引用超过30万次!
下面我们一起来看看如何利用这个著名的Folin酚法测定一个未知样品的蛋白质浓度。
Folin酚法的测定分为两步,分别用到试剂甲和试剂乙,其中试剂甲一般由A液和B液按照50:1的比例配成混合液,此混合液的有效期只能保持1天,过期失效。
试剂甲A液:10g Na2CO3,2g NaOH和0.5g酒石酸钾钠溶解后用蒸馏水定容至500ml。试剂甲B液:0.5g硫酸铜(CuSO4 · 5H2O)溶解后,用蒸馏水定容至100ml,每次使用前将A液和B液按照50:1的比例配成混合液,当天使用。
本实验所用的试剂乙购置于sigma公司,原液为2N,用前稀释一倍使用,并请避光保存。
Folin酚法测定的范围为20-250ug/ml蛋白质,所以标准曲线浓度一般也设定在此范围内,
比如我现在就使用250ug/ml的蛋白质标准液来配制标准曲线,设计标准曲线终体积为1ml,
按这个表中的体积分别加入水和蛋白质标准液,则可得到一系列体积为1ml,浓度从0到250ug/ml之间的不同浓度梯度的蛋白质溶液。
未知样品也加入1ml(注意:未知样品估测浓度应在25-250ug/ml范围内,可通过预实验或梯度稀释来确认)。
标准曲线和样品依次加入试剂甲5ml,室温放置5分钟。
在此期间,试剂甲中的二价铜离子Cu2+与蛋白质形成络合物,并与蛋白质中的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基侧链在碱性条件下发生反应生成一价铜离子Cu+。
5分钟后,蛋白标准曲线管和样品管中依次加入0.5ml 1N福林酚试剂乙,注意,加入试剂乙后应立即混匀,确保试剂乙中的磷钨酸和磷钼酸及时与蛋白质和一价铜离子Cu+的络合物及时发生氧化还原反应,生成蓝色物质钨蓝和钼蓝,
此反应机理尚不完全清楚,所生成蓝色物质在30分钟左右达到稳定的量,由于此反应产物结构尚不清楚,其在可见光红光区呈现较宽的吸收峰区,所以不同的实验指导会选择不同的波长,常用的为640-660nm,700nm和750nm。本实验选用650nm。
等待时请打开分光光度计电源预热30分钟。本次实验使用的是722N分光光度计,相关原理和使用注意事项请参考《722N分光光度计的设计原理和使用规范》课程视频。
首先设置波长为650nm,调节仪器透光率0%,并以标准曲线第一管为空白管调节仪器透光率100%,检查空白管光吸收值为0,拉动样品池拉杆,依次测定标准曲线各管的光吸收值。测完标准曲线后,测定样品,请注意平行样尽量在一组进行测定以减少误差。
测定完成后,以标准曲线样品浓度为横坐标,以每个样品光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线,并根据未知样品的光吸收值,计算未知样品的浓度。
试剂加入体积可根据个人需要按比例调整。
Folin酚法操作简单,灵敏度高,但是会受到Tris、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物、酚类和柠檬酸等多种物质的干扰,而含量较低的尿素(<0.5%)、胍(<0.5%)、硫酸钠(<1%)、硝酸钠(<1%)、三氯乙酸(<0.5%)、乙醇(<5%)、乙醚(<5%)、丙酮(<0.5%)则对显色无影响。
需要特别注意的是:福林酚试剂因含有氯化锂、磷钨酸、磷钼酸和磷酸等酸性物质,属于危险试剂可造成一系列污染和伤害,请务必小心保管和使用,使用后注意按照相关规定排放。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
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-第五节 本课程教学团队介绍
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-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
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--移液器的日常校准
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-第二章 移液器的使用 作业
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--分光光度法的原理
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-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
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--离心机的操作要点
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-第二章 离心机的使用 作业
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-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
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-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
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-第四章 酶活力的测定 作业
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--蛋白质的盐析提纯
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--IMAC亲和层析
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-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
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-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
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-《基础生物化学实验》期末考试