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下一节:紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

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紫外法测定蛋白质浓度的实验原理课程教案、知识点、字幕

前面我们已经谈过了

学习蛋白质定量测定的意义

这一节我们开始学习最简单

的蛋白质定量测定的方法

紫外法的实验原理

此外法又被称为紫外吸收法

或者紫外分光光度法

这个方法测定蛋白质的原理是基于

蛋白质本身在紫外光谱区具有光吸收

而且蛋白质溶液的吸光度A

与蛋白质在溶液中的浓度C成正比

所以就可以利用我们前面学过

的分光光度法进行定量测定

最常用的测定方法是

280纳米光吸收法

因为组成蛋白质的20种氨基酸

中有三种含有芳香环结构

其中共轭双键在紫外区有光吸收

大家还记得是哪三种氨基酸吗

对了

就是酪氨酸色氨酸和苯丙氨酸

其中酪氨酸和色氨酸的最大

光吸收峰就靠近280纳米

因为绝大多数的蛋白质中

都含有这两种氨基酸

所以绝大多数的蛋白质在

280纳米处都具有紫外光吸收

都可以使用这个方法进行定量测定

紫外法测定蛋白质的好处

是不涉及到化学反应

所以快速简便不会受到

低浓度盐类的影响

而且测定后的蛋白质还可以回收使用

对于珍贵的纯蛋白质样品来说

是非常好的测定方法

而对于某一种纯品蛋白来说

其摩尔消光系数(ε)是固定的

所以测定了这种蛋白质在

280纳米处的吸光度

A值

就可以根据公式C=A/ε

直接计算出这种蛋白质的浓度

又或者查到某一蛋白质

的百分消光系数    

这也是一个很有用的参数

它代表了某一种1%

浓度的蛋白质溶液

在光径一厘米时候的吸光度值

也有文献称之为

百分吸光系数写成E%

知道了百分消光系数

我们就可以很容易的计算出

某个蛋白质溶液的浓度

因为1%的蛋白质溶液浓度

约为10毫克每毫升

所以蛋白质浓度就等于

A280×10除以百分消光系数

比如说我们最常用的牛血清白蛋白

的百分消光系数等于6.3

如果一份牛血清白蛋白的溶液

它的吸光度值是0.63

那么这份溶液的浓度就可以通过

0.63×10÷6.3

即可计算出来它的浓度

是一毫克每毫升

这样通过测定紫外吸光度值方便快捷

的直接计算蛋白质浓度的方法

只适用于纯蛋白溶液

也就是说只有溶液中有且

只有一种蛋白质的情况

而且还需要提前查阅或者计算出

蛋白质的摩尔消光系数或者百分消光

系数

实际上我们经常都需要测定

的蛋白质混合物的浓度

或者某些无法获得这些

参数的蛋白质的浓度

这种情况下就要用我们前面讲过的

分光光度法来进行测定

通过让未知浓度蛋白质样品和标准

曲线或标准品的紫外光吸收值进行

比较

而计算出蛋白质的浓度

所以问题来了

不同种类的蛋白质

紫外光吸收值是一样的吗

事实上不同的蛋白质

酪氨酸和色氨酸的含量不一样

所以单位浓度的不同

蛋白质在280纳米处的

吸光度值是有差异的

比如我们在前面的计算中知道牛血清

白蛋白的百分消光系数是6.3

而溶菌酶的百分消光系数是22.8

相差三倍以上

也就是一毫克每毫升的牛血清

白蛋白在280纳米处的

吸光度值是0.63

而一毫克每毫升的溶菌酶在280

纳米处的吸光度值则会达到2.28

所以如果未知浓度样品的蛋白质中

酪氨酸和色氨酸的含量与标准品

蛋白质的差异较大

最后计算出的结果就会产生误差

此外

生物样品粗提物中除了蛋白质

往往还含有核酸

大家还记得核酸的最大

吸收峰在多少纳米吗

是的 在260纳米

但是从这张图上我们可以看出

核酸在280纳米也

具有一定的光吸收

所以如果溶液中除了蛋白质

还有核酸的话

我们测定的280纳米的光

吸收值就会有核酸的贡献

如果把光吸收全部当作蛋白质来计算

所得的数值就会比实际

蛋白质的浓度要高

进而造成较大误差

这就需要进行校正

尽量去除掉核酸的影响

常用的矫正方法是利用280纳米

和260纳米的吸收差法

已知纯蛋白在280纳米处的

吸光度值约为260纳米处

吸光度值的1.8倍

而纯核酸在280纳米处的

吸光度值约为260纳米处

吸光度值的0.5倍

所以对于含有核酸的蛋白质溶液来说

分别测定280纳米和260

纳米的吸光度值

然后用经验公式计算蛋白质浓度

也就是说蛋白质浓度等于

1.45×280纳米的光吸收再减去

0.74×260纳米处的光吸收

请注意经验公式是利用不同浓度

比例的酵母烯醇化酶和酵母

核酸混合液所测定的数据来建立

不同的蛋白质和核酸也会有误差

所以这个方法只能粗略的计算

含有核酸的蛋白质样品浓度

此外也可以先计算出A280

比上A260的比值

从经验表格中查出矫正因子 F的值

利用F值通过以下校正公式

计算蛋白质的浓度

蛋白质浓度=F×1/d×A280

其中d为比色杯光径的厚度

在我们学生实验中最常用的

是一厘米的比色杯

那么这个公式就可以简化为

蛋白质浓度等于F×A280

比如某个样品用一厘米的比色杯测定

的280纳米的吸光度值为0.65

260纳米的吸光度值为0.5

我们首先先算出280纳米和260

纳米吸光度值的比值1.3

可以在表格中查出此时核酸

的含量大约是1.25%

F值为0.97

此时蛋白质的浓度就是

0.97×0.65即0.63

请注意这个表格同样是利用不同

浓度比例的酵母烯醇化酶

和酵母核酸混合液所测定

的数据来建立的

蛋白质和核酸的种类不同

或者还有其他紫外光吸收的物质

都会导致计算的误差

此外

还有通过215纳米和225纳米

吸光度值校正的方法

和测定238纳米

吸光度值肽键校正法

但都存在误差

这里就不详细介绍了

感兴趣的同学可以自己查阅资料学习

总的来说

利用紫外光吸收测定蛋白质

浓度的方法中

最常用的还是利用标准曲线法

比色测定

而最佳试用样品

是经过纯化后得到的纯蛋白溶液

在下一节中我们将一起学习

利用标准曲线法测定蛋白质

紫外吸光度值

并计算蛋白质溶液浓度

的具体操作方法

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

紫外法测定蛋白质浓度的实验原理笔记与讨论

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