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淀粉酶米氏常数的测定和计算


学过《生物化学》酶学部分，我们都已了解底物浓度会影响酶促反应速率，而酶动力学研究的核心就是底物浓度与酶促反应速率变化的关系。

从1913年两位科学家提出M-M模型以后，1925年另外两位科学家进一步完善了此数学模型，建立了同学们已经熟悉的米氏方程，

淀粉酶Km1.png

其中其中KM为米氏常数，Vmax为最大反应速率，[S]为底物浓度，v为反应速度。

米氏常数KM是米氏酶的特征常数，同一个酶对不同的底物有不同的KM，其中KM越低意味着酶与此底物亲和力越大，所以通过测定KM可以判断酶的最适底物，还可以通过KM判断反应方向。

1934年，两位科学家进一步提出将米氏方程取倒数后推导出此公式，

淀粉酶Km2.png

在此公式中，KM/Vmax是一个常数，1/Vmax也是一个常数，而酶促反应速率1/v和底物浓度倒数1/[S]都是变量，所以当配制一系列不同底物浓度的反应体系加入等量的酶后，计算对应的反应速度，做图就可以得到一条直线，此直线的纵轴截距等于1/Vmax，横轴截距的值为1/KM，由此就可以计算出此酶的KM和Vmax两个重要常数。但是，很多同学在实际测定和计算的过程中，关于底物浓度和反应速度计算体系容易有所混淆，所以我们这里以α-淀粉酶为例，一起来看一下如何用双倒数作图法计算酶的米氏常数。

我们以α-淀粉酶水解淀粉，利用3,5-二硝基水杨酸测定产物麦芽糖浓度的方法为例，在此反应中，首先配制一系列不同浓度的底物淀粉溶液3 ml，淀粉液用酶的最适反应溶剂体系配制，预热到40℃，在每只试管中加入1ml等温的酶液，反应5分钟后，在各管中均加入4ml NaOH使反应终止，将8 ml酶反应体系中的反应液转移1 ml到新试管，与麦芽糖标准曲线一起加入3,5-二硝基水杨酸，沸水浴加热5 min，然后稀释定容到15 ml，利用可见光分光光度计在520 nm处测定吸光度值。

根据一系列浓度梯度的麦芽糖标准曲线与3,5-二硝基水杨酸反应生成的3-氨基5-硝基水杨酸在520 nm处的吸光度值，我们可以计算出麦芽糖浓度与吸光度的对应关系。

接下来我们来看不同底物浓度的酶反应管。我们利用10mg/ml的淀粉标准液和柠檬酸缓冲液配制一系列不同淀粉浓度的溶液，接下来我们先计算公式中的底物浓度，所以第一个问题来了，底物浓度应该是淀粉加柠檬酸的3 ml体系中的淀粉浓度还是淀粉加柠檬酸再加酶液的4 ml体系中的浓度呢？
注意：和酶起反应的底物一定是混合了酶液的底物，所以，能体现差异的底物浓度，必须是即有底物又有酶液的酶反应体系中的底物浓度。
所以我们的计算方式应该是淀粉体积 (ml) × 10 mg/ml ÷ 4 ml，并由此计算出底物浓度的倒数。

我们对一系列不同底物的酶促反应管进行测定后得到其产物在520 nm处的光吸收，可计算出所测定的各管中麦芽糖的浓度，请注意：计算1-10号管的麦芽糖浓度时需要先扣除对照管的吸光度，因为这代表体系背景的光吸收。
接下来，第二个问题来了：通过与标准曲线比对计算出的产物麦芽糖浓度应该是加入淀粉、酶和NaOH后总共8 ml体系中的产物浓度，而我们知道，反应速度是单位时间内生成产物的浓度，那么是不是这个计算出的浓度除以酶促反应时间5 min就是反应速度了呢？
请注意，产物浓度也应该是酶反应体系中的产物浓度，也就是要换算到只有淀粉和酶液的反应体系中，单位时间所生成的产物浓度，在米氏方程作图过程中，只有底物和产物的浓度都是以相同体系计算才有可比性，我们可以反过来想，如果关于反应速度的计算不用换算为反应体系中的浓度，那么在反应终止的过程中，加入NaOH的量变化，反应速度就会相应变化，这是不是很不合理？
本实验中反应体系是3 ml淀粉加1 ml酶液的4 ml，而我们刚刚利用标准曲线计算的产物浓度是3 ml淀粉加1 ml酶液再加4 ml NaOH总共8 ml体系中的麦芽糖浓度，所以需要将此浓度乘以8 ml再除以4 ml，得到的才是反应体系中生成的产物浓度，在此基础上除以反应时间5 min，即可得出反应速度，并进而求出反应速度的倒数。

现在我们就计算出了不同底物浓度下的反应速度，用底物浓度和速度的倒数分别作为横纵坐标，绘制双倒数图，并且得到了此直线的斜率和截距，现在考考你，5.6853和0.9978两个数各代表什么常数，如何计算KM和Vmax呢？

根据双倒数作图的公式，我们可以知道纵轴截距的值应该等于1/Vmax，而斜率除以截距就等于KM的值。这就是米氏方程双倒数作图的基本过程。

在设计和实施米氏方程双倒数作图法求KM值的过程中，同学们要注意几点：
首先是底物浓度的设计的环节，在一定浓度范围内，为了计算方便和减少误差，可尽量避免选择倒数为无限循环小数；
此外，无论是计算底物浓度还是通过产物浓度计算反应速度，注意计算体系应该是酶反应体系；
第三点是，实际操作过程中，应注意各管之间加入酶液和终止反应的时间差，尽可能确保每只试管中的反应时间一致，否则将难以得到准确的KM和Vmax数据。

 


下一节:淀粉酶米氏常数测定的实验指导

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基础生物化学实验课程列表：

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么？

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--《生物化学实验》学什么？

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习？

--不同需求的同学如何学习本课程？

--不同需求的同学如何学习本课程？

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

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--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

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--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

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--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

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--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

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--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

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--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

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--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素（VB2）荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗？

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

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-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作（Folin酚法）

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--菠萝蛋白酶比活力的测定（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶比活力的测定（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力的计算（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力的计算（Folin酚法）

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作（Folin酚法）

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--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

-第四章 酶活力的测定 作业

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-查阅一个你感兴趣的酶，想想怎么测？

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

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第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

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--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

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--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳，还有什么用于生物大分子鉴定的方法？

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

淀粉酶米氏常数的测定和计算笔记与讨论

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