当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第二节 核酸的提取和检测 > 核酸的制备原理及基本步骤
同学们 大家好
在这里我们将一起了解脱氧核糖核酸
DNA制备过程遵循的原则
及基本步骤
大家或多或少都对核酸有一定的认识
核酸分为核糖核酸RNA
和脱氧核糖核酸
DNA
DNA是遗传物质存在于
真核生物的细胞核中
如图1所示
原核生物 大肠杆菌
DNA存在于细胞的拟核中
真核生物细胞中的基因组
DNA是双链线性分子
其基本结构单位是组蛋白
和DNA形成的核小体
如图3 所示
原核生物的基因组DNA
是双链环形分子
它与DNA结合蛋白及
RNA形成特定的结构
由此可知DNA总是和
蛋白质结合在一起
当你分离制备DNA时
最需要解决的问题自然就是
如何更好的去除蛋白质
获得DNA
其次
DNA是具有生理活性的生物大分子
如果在制备过程中DNA发生降解
变性或者断裂或者提取的DNA
样品中含有其他杂质
你的DNA制备就是失败的
所以制备DNA时一定要保持其
完整性和保持DNA的纯度
如何在实验过程中获得完好的DNA
分子
首先需要注意避免化学
物质对DNA的降解
过酸或者过碱以及一些化学物质
都有可能导致DNA发生降解
因此提取制备DNA时
提取缓冲液pH 范围最好保持在
5.5~9.0之间
其次注意避免核酸的生物降解
细胞内各种核酸酶都
有可能切断DNA
分子中脱氧核糖核苷酸之间
的 3’,5’-磷酸二酯键
导致核酸降解
因此在提取DNA的缓冲液中
需要加入抑制DNA酶的
物质
比如EDTA
柠檬酸盐
等物质以鳌合DNA
酶发挥作用所需要的金属离子
镁离子
还有一点非常重要的
值得注意的是
对于真核生物基因组
DNA这种长的线状分子而言
机械损伤是导致你无法分离获得
完整DNA分子的重要原因
所以在DNA制备过程中
绝对不能采用强烈振荡
剧烈搅拌以及高温煮沸等操作
为了消除DNA制备样品中
的微量RNA最有效的方法是
加入RNase酶来降解DNA
样品中微量的RNA杂质
以上是DNA制备的原则
换句话说就是分离DNA时
不仅要保持DNA一级结构的完整性
还要排除蛋白质等其他
物质以及RNA的污染
了解了DNA制备的原则
制备DNA具有哪些基本步骤呢
第一需要将DNA从细胞中释放出来
因此破碎组织和细胞是第一步
动物组织比较脆弱
简单的机械匀浆或者组织
研磨就可以破碎细胞
而植物和微生物组织存在
细胞壁比较牢固
可分别采用
组织捣碎法
超声波破碎等方法
在此过程中常常会加入溶菌酶
破坏细菌细胞壁
加入SDS
即十二烷基硫酸钠
该物质能够破坏植物细胞壁和细胞膜
SDS不仅是很好的细胞消溶剂
而且具有抑制核酸酶的作用
还能使细胞内蛋白质发生变性
达到将DNA和与之
紧密结合的蛋白质
以及其他蛋白质有效分离的目的
当细胞破碎后
进一步的操作就是需要
去除细胞中的蛋白质
脂质 多糖等杂质
刚才说的SDS就
有去除蛋白质作用
此外还有很多方法
例如酚抽提法
浓盐法
CTAB法等等
这里简单介绍一下CTAB
也就是十六烷基三乙基溴化铵
是一种去污剂
用于抽提DNA
该试剂不仅能够溶解细胞膜
而且能够与核酸形成复合物
在特定条件下
研究人员可以将核酸CTAB
复合物与蛋白质
多糖等杂质分开
达到制备核酸的目的
通过应用上述不同蛋白质去除的方法
你就可以获得DNA样品
但是注意了
此时你获得的DNA
溶液可能仍然含有一些低分子量
物质
或者含有少量高分子量 蛋白质
粘多糖或者含有微量的RNA
所以还需要完成核酸的纯化过程
核酸纯化的方法有很多
例如超速 离心法
柱层析法 凝胶电泳等等
这里就不再进行介绍了
以上是进行DNA提取
的原则和基本步骤
在之后的视频中
我将介绍碱裂解法进行小量
质粒DNA的提取过程
谢谢大家的参与
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