当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第一节 蛋白质的定量测定 > 双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理
我们已经学过了紫外法测定蛋白质浓度,但我们也知道在紫外区会有核酸等物质的干扰,导致测定结果不准确。今天我们来学习另一种测定蛋白质的方法——双缩脲法,这也是一个非常经典的蛋白质定量测定方法。
什么是双缩脲呢?两分子尿素在180℃的条件下,缩合,释放出1分子的氨,形成的化合物就叫“双缩脲”。
双缩脲这种物质在碱性溶液中可以和铜离子发生反应生成紫红色络合物。
大家看双缩脲分子的结构式,其中的酰胺基的部分是不是和蛋白质的肽键很相似?
所以含有肽键的肽和蛋白质也同样可以在碱性条件下和铜离子发生反应生成紫红色络合物。此络合物颜色的深浅和蛋白质的浓度成正比。因为是和肽键发生反应,所以颜色深浅与蛋白质的氨基酸组成和蛋白质的分子量无关,不同种类蛋白质所生成产物颜色接近,这一点和紫外法不同。
所生成的紫红色络合物在紫外区和可见区都有光吸收,而且在260-280 nm处有最大光吸收,但是因为此区域干扰因素和空白管光吸收都比较强,实际测定中常用540nm进行测定,这一点我们在前面《分光光度法测定物质浓度的实验设计》一节中已经讨论过。
此方法测定蛋白质的浓度范围在1-10 mg/ml,会受到Tris、蔗糖、甘油等物质的影响。
具体操作是取9支试管,按照实验指导中设计的管号依次做好标记,请将标记做在试管上部,避免在后期水浴中造成标记模糊不清,影响测定和记录。
按实验指导的标准曲线先依次加入设计体积的水,然后再依次加入设计体积的标准蛋白质溶液,更换吸头,在三支样品管中各加入1 ml待测溶液。然后统一加入4 ml双缩脲试剂,混匀,放置30分钟。
请注意,对于所有需要发生化学反应进行测定的定量方法来说,标准曲线和待测样品需要在短时间内依次加入反应试剂,不能分别完成标准曲线和待测样品的测定,那将因周围环境和试剂条件等因素造成较大误差。
加入双缩脲试剂反应期间,打开分光光度计电源预热,调节波长至540nm。反应结束,先调节分光光度计透光率T=0%,以标准曲线第一管为空白管,按照仪器的操作流程调节仪器透光率T=100%,依次测定标准曲线各管,更换溶液请按我们前面所讲的方法正确润洗比色杯,期间请保持空白管一直在分光光度计内,每次打开样品池盖更换样品都要检查空白管透光率T=100%。
测完标准曲线后,继续将空白管保留在样品池内,其余比色杯用去离子水彻底清洗,然后依次用各样品管润洗后测定样品管的吸光度值,正确记录所有实验数据。
实验结束,关闭分光光度计,取出所有比色杯,彻底洗涤后倒置晾干,分析数据,计算结果。
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