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双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

我们已经学过了紫外法测定蛋白质浓度,但我们也知道在紫外区会有核酸等物质的干扰,导致测定结果不准确。今天我们来学习另一种测定蛋白质的方法——双缩脲法,这也是一个非常经典的蛋白质定量测定方法。

什么是双缩脲呢?两分子尿素在180℃的条件下,缩合,释放出1分子的氨,形成的化合物就叫“双缩脲”。
                                               


双缩脲这种物质在碱性溶液中可以和铜离子发生反应生成紫红色络合物。

图片1.png

大家看双缩脲分子的结构式,其中的酰胺基的部分是不是和蛋白质的肽键很相似?

所以含有肽键的肽和蛋白质也同样可以在碱性条件下和铜离子发生反应生成紫红色络合物。此络合物颜色的深浅和蛋白质的浓度成正比。因为是和肽键发生反应,所以颜色深浅与蛋白质的氨基酸组成和蛋白质的分子量无关,不同种类蛋白质所生成产物颜色接近,这一点和紫外法不同。

双缩脲原理3.png

所生成的紫红色络合物在紫外区和可见区都有光吸收,而且在260-280 nm处有最大光吸收,但是因为此区域干扰因素和空白管光吸收都比较强,实际测定中常用540nm进行测定,这一点我们在前面《分光光度法测定物质浓度的实验设计》一节中已经讨论过。

此方法测定蛋白质的浓度范围在1-10 mg/ml,会受到Tris、蔗糖、甘油等物质的影响。

具体操作是取9支试管,按照实验指导中设计的管号依次做好标记,请将标记做在试管上部,避免在后期水浴中造成标记模糊不清,影响测定和记录。
按实验指导的标准曲线先依次加入设计体积的水,然后再依次加入设计体积的标准蛋白质溶液,更换吸头,在三支样品管中各加入1 ml待测溶液。然后统一加入4 ml双缩脲试剂,混匀,放置30分钟。
请注意,对于所有需要发生化学反应进行测定的定量方法来说,标准曲线和待测样品需要在短时间内依次加入反应试剂,不能分别完成标准曲线和待测样品的测定,那将因周围环境和试剂条件等因素造成较大误差。

双缩脲原理4.png

加入双缩脲试剂反应期间,打开分光光度计电源预热,调节波长至540nm。反应结束,先调节分光光度计透光率T=0%,以标准曲线第一管为空白管,按照仪器的操作流程调节仪器透光率T=100%,依次测定标准曲线各管,更换溶液请按我们前面所讲的方法正确润洗比色杯,期间请保持空白管一直在分光光度计内,每次打开样品池盖更换样品都要检查空白管透光率T=100%。
测完标准曲线后,继续将空白管保留在样品池内,其余比色杯用去离子水彻底清洗,然后依次用各样品管润洗后测定样品管的吸光度值,正确记录所有实验数据。
实验结束,关闭分光光度计,取出所有比色杯,彻底洗涤后倒置晾干,分析数据,计算结果。

 


下一节:双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

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第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

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-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

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-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

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-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

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-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

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--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

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-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

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--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

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--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

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-第四章 酶活力的测定 作业

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-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

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--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

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--拟南芥叶片基因组DNA提取

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--紫外分光光度法测定核酸

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

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--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

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--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理笔记与讨论

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