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菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)
一、 实验试剂
1. 0.1 M磷酸缓冲液(PBS,pH 7)
2. 0.1 mg/mL酪氨酸:称取100 mg酪氨酸粉末溶解在纯水中,定容到1 L。
3. 0.55 mol/L Na2CO3:称取58.3 g Na2CO3溶解在纯水中,定容到1 L。
4. Folin酚试剂(Sigma,F9252):所购买Folin酚试剂为2N,使用前用纯水稀释1倍,装入棕色玻璃试剂瓶使用。
5. 1% 酪蛋白:称取1 g酪蛋白粉末,加入少量0.1 M NaOH润湿,再加入0.1M pH 7磷酸缓冲液约80ml,70℃水浴加热搅拌至彻底溶解,然后定容到100ml。
6. 15%三氯乙酸(TCA):称取15 g三氯乙酸溶解在纯水中,定容到100 ml。
7. 考马斯亮蓝G-250溶液:称取100 mg考马斯亮蓝G-250,溶于50 ml 95%乙醇中,加入85%的磷酸100 ml,纯水定容到1 L,滤纸过滤。
8. 标准蛋白质溶液:0.25 mg/ml牛血清白蛋白溶液。
准确称取烘干恒重的牛血清白蛋白0.25 g,加入约800 ml纯水,搅拌溶解后定容到1 L。
9. 茎菠萝蛋白酶液。
二、 实验器材
移液器、可见分光光度计(含比色杯)、恒温水浴锅、台式高速离心机
三、 实验步骤
1. 菠萝蛋白酶活力测定
取4支试管,分别标记为1支对照管和3支测定管,加入酶液和磷酸缓冲液各0.5 mL,37℃保温2 min,在对照管中加入1 mL 15%三氯乙酸,然后每支试管中加入已温浴到37℃酪蛋白1 mL(请注意提前将酪蛋白溶液放入水浴锅温浴),轻轻震荡混匀,37℃保温10 min,立即在测定管中加入1 mL 三氯乙酸终止反应。
然后从每支酶反应管中取适量上清液,转移入2ml离心管,14000 rpm离心5 min,小心吸取0.5mL上清液,分别转移到干净的试管中,与标准曲线一起依次加入4 mL的0.55 mol/L Na2CO3,然后再依次加入0.5 mL Folin酚试剂,立即颠倒混匀,室温放置30 min后,680nm处测定吸光度值。
2. 酪氨酸(Tyr)标准曲线绘制
按下表配制标准曲线各管,并准备好酶反应液管,所有试管中依次加入4 mL Na2CO3,然后再依次加入0.5 mL Folin酚试剂,立即颠倒混匀,室温放置30 min后,680nm处测定吸光度值。
3. 菠萝蛋白酶蛋白质含量测定
按下表配制牛血清白蛋白标准溶液,另取3支试管各加入0.2 mL菠萝蛋白酶溶液,与标准曲线一起加入4 mL考马斯亮蓝染液,反应2 min后,595nm处测定吸光度值,计算酶液中蛋白质浓度,进而计算此酶制品的比活力。
4. 绘制酪氨酸标准曲线,以每分钟水解酪蛋白生成1 ug酪氨酸的酶量为1个活力单位(U),计算菠萝蛋白酶的活力,并根据蛋白质测定结果,计算菠萝蛋白酶溶液中的蛋白质含量,进而计算菠萝蛋白酶的比活力(U/mg)。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
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-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
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-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
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--移液器的日常校准
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-第二章 移液器的使用 作业
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--分光光度法的原理
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-第二章 分光光度计的使用 作业
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-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
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-第二章 离心机的使用 作业
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-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
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-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
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-第四章 酶活力的测定 作业
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--蛋白质的盐析提纯
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--盐析操作注意事项
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--离子交换层析
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--核酸琼脂糖电泳-作业
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