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酶活力测定的常用方法课程教案、知识点、字幕

酶作为生物催化剂与社会的发展

和我们的生活息息相关

酶在过去的100多年间

不仅是科学研究的重点

同时也在医学和工业生产

方面发挥着巨大的作用

作为任何一个生物体

新陈代谢都必不可少的是催化剂

对于生物酶功能的研究从未停止

而且随着新技术的不断涌现

和研究手段的逐渐更新

关于生物酶的功能研究也越来越深入

不断刷新着人类对生命本质的认识

同时一大批酶已经成为

现代研究技术的工具

比如说限制性 内切酶

连接酶用于基因重组的操作

胰蛋白酶用于细胞培养操作等等

他们早已经成为科研中必不可少的工具

在研究中人们还发现许多酶

都可以作为疾病治疗的靶点

比如逆转录酶

他的抑制剂可以用于治疗HIV的感染

而端粒酶则成为肿瘤治疗的靶点之一

此外

酶还与我们每个人的健康和生活息息相关

比如说我们生病了去医院

医生会要求化验血液和尿液

有时就是要检验我们机体中酶活力的变化

指导医生

正确判断病情

如果一个人血液中转氨酶

的活力大幅度上升

那么这个人很可能是患上了

肝脏疾病或者心脏疾病

如果一个人的血液或者尿液中

淀粉酶的活力大幅度上升

则非常有可能是急性胰腺炎

或者流行性腮腺炎

配合其他的相关检查

就可以让医生了解我们的身体是哪里

出了问题

该如何治疗

另一方面

这些指标的监测还可以提示

医生疾病的治愈程度

生了病需要吃药

很多药物也是酶制剂或者

是利用酶来生产的

比如说消化不良的时候

可以吃些蛋白酶

帮助分解蛋白质助消化

而尿激酶可以溶解血栓

治疗心脑血管疾病

青霉素酰化酶可以用于制备头孢霉素

而β-酪氨酸酶

则用于生产多巴等等

除了医药领域

我们生活中常用的大量工业制品

其生产过程都离不开酶的参与

比如在食品加工业

我们利用淀粉酶来水解淀粉制糖

利用木瓜蛋白酶适度水解蛋白纤维

使肉类的口感更嫩

利用葡萄糖氧化酶

防止啤酒氧化

保持风味

利用溶解酶则可以防止细菌的滋生

除了吃的

食品

我们穿的衣服很多是用淀粉酶完成退浆

纤维素酶的处理可以让棉

织物的手感更加舒适

适度的蛋白酶处理可以让我们

的毛衣不宜沾化缩水

我们日常所用的纸张也可以用

漆酶分解木质素达到漂白的目的

说了这么多酶的重要作用

大家就明白为什么那么多科学家都在研究

而儿那么多工厂都在生产

酶了吧

无论是研究酶还是生产酶

我们都面临着一个首要问题

就是酶的定量

也就是我们该如何衡量酶的多少

如何测定酶呢

我们在分析化学的课程中

学过很多物质的定量测定

基本上绝大多数物质的定量都可以用

浓度或者质量的单位来进行衡量

比如我获得了一份蛋白冻干粉

它的质量是1.5克

这是明确的定量

又比如说我得到了一份核酸溶液

它的浓度是一毫克每毫升

这也是一个明确的定量

那么酶是不是也可以如此简单的

用质量或者浓度来进行定量

我们都知道绝大多数酶的本质

是有催化活性的蛋白质

但是对一个酶制剂来说

蛋白质浓度高就一定代表可以催化

更多的底物分子转化成产物吗

显然不是

因为制剂中有部分酶分子可能会失去活性

所以说单纯的测定蛋白质浓度是无法

体现这份酶制剂的活力高低的

换句话说

就算我们

可以保证这份酶制剂里都是纯的酶蛋白

也无法知道其中有多大比例

的酶蛋白是有活力的

有多少是没有活力的

比如说这两份酶制剂

你会选择哪一份

蛋白质多的

还是蛋白质少的呢

因此要评价一份酶制剂的质量

我们必须要知道的是

这两份酶制剂可以干多少活

而不是说里边有多少个蛋白质分子

评价指标就是酶的活力单位

上个世纪60年代以前

酶活力单位的定义

多数是以建立方法的科学家名字来命名

比如测定转氨酶的单位有金氏法

使用的金氏单位,穆氏法使用的穆氏单位

结果同一种酶也会使用多种单位

给实际工作带来不便

为了便于标准化比较

1963年国际深化协会酶学委员会

推荐采用国际单位(IU)来统一

表示酶活性的大小

将酶活性的单位定义为在特定条件下

一分钟催化一微摩尔底物转化的酶量

所以一个IU就等于一微摩尔每分钟

有些实验室会省略掉国际一词

也就是说将IU写为U

不过在实际工作中

为了计算和比较的方便

有些酶还是会延续使用自定义的活力单位

明确了酶活力单位的定义

接下来我们要思考的就是实际工作

中到底该如何设计实验来精确

的测定酶催化反应的速度

首先

酶活力的测定一般要在最适反应条件下

也就是首先要提供给酶最适温度

最适ph值和最适离子强度

确保酶可以最大限度的发挥其功能

有了合适的环境

我们还要做到一点

要保证我们测的是反映的初速度

因为随着反应的进行

酶活力可能会受到体系变化

底物减少和产物堆积等复杂因素的影响

所以要尽可能的测定反应初期的初速度

要保证初速度

常采用的手段无外乎两个

一是控制反应时间

在比较短的时间内完成测定

另一个就是增加底部的浓度

确保底物大过量

不会限制酶的工作效率

确定了最适反应条件和初速度

接下来我们要做的是搞清楚酶到底

转化了多少底物变成产物

要知道这一点

我们需要做的是检测底物的减少量

或者是产物的增加量

可是无论是底部的减少

还是产物的增加

显然都不是肉眼可见的

我们必须要建立对底物或者

产物有效可信的测定方法

实际上我认为这才是一个酶活力

测定实验中最核心的部分

而实际工作中因为底部往往大过量

因此对底部减少的测定可能准确度不高

人们会尽量采取测定产物增加的方法

为了便于说明和比较

我们本次课就依照对底物

和产物测定方法的不同

大致分成三类来介绍

让我们先从最简单的开始

当代测定物质直接就可以

产生明确的可检测信号

比如说

生成的产物有颜色

或者是在可见光下有光吸收

或者是由紫外光吸收

又或者能发出荧光

又或者可以检测到同位素的剂量

当然最常用最方便的

而且最便宜的还是直接测

紫外或者可见光吸收

举个例子说

如果我们要测定细胞色素C氧化酶

可以使用还原型细胞色素C作为底物

经过细胞色素C氧化酶的催化

生成氧化型的细胞色素C

其中还原型细胞色素C

在560纳米处有光吸收

而生成的氧化性细胞

色素C

没有光吸收

由此就可以通过连续监测560

纳米处光吸收的变化

来计算底物减少的量

进而推算出酶的活力

可是绝大多数情况下我们并没有这么幸运

大多数酶的底物和产物分子都没有

可以很方便直接测定的光吸收

也可以说没有明确的可检测信号

我们能想到最直接的解决思路就是让没有

检测信号的分子变成可检测的衍生物

比如说当我们要测定碱性磷酸酶的时候

可以用α-磷酸萘酚作为底物

通过碱性磷酸酶催化水解掉一分子磷酸

生成α-萘酚

而α-萘酚没有光吸收

但是可以马上与体系中的偶氮试剂反应

生成在405那米处有光吸收的重氮色素

然后通过分光光度计检测

405米处的光吸收增加

进而推算出α-萘酚的生成速度

计算出酶的活力

通过一步反应生成有光吸收的物质

这个方法虽然比直接法稍微复杂一点

设计实验的时候要确保所有的酶反应

直接产物都可以快速的反应

生成可检测的物质

总的来说

直接测定和间接测定的方法都不复杂

可是非常不幸

有的酶催化的反应既不能

生成直接可检测的物质

也没有合适的方法可以

发生快速的化学反应

生成可检测的物质

这怎么办呢

遇到这种情况还可以看看

新生成的产物有没有可能

通过其他的酶催化

得到可检测的信号

如果可以的话

可将两个酶学反应偶联得到可检测的产物

通过检测第二个反应的产物

推算出第一个反应的产物量

进而计算酶活力

听起来很复杂

我们不如来看个例子

比如己糖激酶

它可以催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖

可不幸的是无论葡萄糖还是6-磷酸

葡萄糖都没有光吸收

也无法很方便的通过一个化学反应

生成有光吸收的物质

怎么办呢

有人发现另一个酶

6-磷酸葡萄糖脱氢酶

可以催化6-磷酸葡萄糖生成

6-磷酸葡萄糖酸内酯

虽然内酯也没有光吸收

但是在反应的过程中会同等催化

等mol的NADP生成NADPH

大家都知道

NADPH可是在340

纳米处有光吸收的

因此就可以通过检测340纳米处的

光吸收的增加来推测生成6-磷酸葡萄糖的

速度

进而计算出己糖激酶的活力

说到这里 你有没有想过

这类两个酶反应

偶联的方法在实际应用中要注意什么呢

一定要记住

你要测定的是第一个酶

而第二个酶反应只是不得已而为之

要尽量降低他的存在感

也就是一定要确保第一个酶是限速步骤

要做到这一点

选择第二个偶联反应的时候

从反应原理上就要确保第一个反应的

产物可以立即与第二个酶发生反应

生成最终产物

同时为了保证第二个反应

不会成为限速步骤

还要多加一点催化第二个反应的酶

让他过量

瞬间把第一个反应生成的产物全都反应掉

最后还要提醒的是

选择偶联反应的时候

可不能只看反应方程式

一定要选择与第一个酶最适条件接近

的第二个酶来催化第二个反应

不然第二个酶可是不会好好干活的

以上是关于酶活力测定

实验设计的基本思路

接下来我们将以具体的酶活力

测定实验原理和操作为例

学习和体会酶活力测定实验的

设计思路和操作注意事项

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

--离子交换层析

--亲和层析

--亲和层析

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

酶活力测定的常用方法笔记与讨论

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