当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第四章 酶活力的测定 > 第二节 菠萝蛋白酶活力的测定 > 菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)
蛋白酶也称作蛋白水解酶和肽酶
是水解肽键的一类酶的总称
是所有生物生存必需的一类酶
蛋白酶在生物体的正常生命活动和
工业生产中都发挥着重要的作用
生物体内食品消化
蛋白循环 凝血级联系统
蛋白活化等诸多过程都需要蛋白酶的参与
而工业生产中食品加工
清洁医疗等领域也都有蛋白酶的身影
人体内很多蛋白酶本身就是
药物治疗的潜在靶点
因此说蛋白酶的活力测定作为研究
蛋白酶的基础具有重要的意义
不同的蛋白酶催化类型不同
现在通常分成6种
分别是丝氨酸型 苏氨酸型 半胱氨酸型
天冬氨酸型
谷氨酸型和金属型
蛋白酶的活性中心通常在分子
表面两个结构域之间的沟里
而沟的一侧或者两侧的结合
位点就决定了酶的特异性
大多数蛋白酶的活力测定方法是一致的
我们就以菠萝蛋白酶为例
学习蛋白酶活力测定的
实验原理和实验设计
菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶 无花果蛋白酶
动物组织蛋白酶等同属于
半胱氨酸型蛋白酶
指的是菠萝茎或者菠萝
果汁中的所有蛋白酶
一般存在于茎中的称为茎菠萝蛋白酶
提取自果肉的称为果菠萝蛋白酶
他们都是单链糖蛋白
菠萝蛋白酶在工业上有着广泛的应用
包括生物清洁剂 烘焙工业
食品工业
化妆品工业
制药和医疗 饲料 酿酒工业
乳制品加工等等
所以对菠萝蛋白酶的测定
对其提纯 加工和使用都具有重要的意义
接下来我们就一起来学习
研究表明
菠萝蛋白酶的最适ph值在7左右
酶活力最高的温度在60度左右
我们在实际测定中
采用菠萝蛋白酶最适的
ph7的磷酸缓冲液
常用的蛋白酶测定温度为37度
在这个条件下加入酪蛋白底物
让菠萝蛋白酶水解酪蛋白
生成氨基酸混合物
其中生成的酪氨酸可以与
Folin酚试剂发生氧化还原反应
生成蓝色的钨蓝和钼蓝
蓝色物质的量与水解蛋白
所生成的酪氨酸的量成正比
通过测定680纳米处的
光吸收测定酪氨酸的生成量
并进而计算菠萝蛋白酶的活力
以每分钟水解酪蛋白生成一微克酪氨酸
所需要的酶量为一个活力单位
所以我们要做的就是让酶水解酪蛋白
然后测定体系中生成了多少酪氨酸
针对这个实验原理
我们需要完成两方面的工作
一是酶的水解反应
还有就是酪氨酸的测定
关于酶的水解反应
我们需要考虑反应体系的
ph值和温度的达成
以及酶促反应时间的精确控制
反应体系的达成
我们通过在体系中加入
适当的缓冲液来实现
温度则将试管在水浴锅里保温
因为反应时间是从酶和底物
接触开始到终止反应为止
所以我们需要提前将酶
和底物分别进行温浴
这样它们混合的时候才
不会导致温度的波动
需要注意的是
酶在水浴中可能会逐步失活
所以酶液温浴的时间要控制的尽可能短
而且要精确计时
确保不同批次的样品之间的可比性
将预热的酪蛋白加入到
ph7的酶液体系中
反应就开始了
从这一刻起就要
精确计时
直到反应终止
我们终止反应采用的是加入三氯乙酸
这是一种酸性的蛋白质
沉淀剂
会改变体系的ph值
并且使蛋白质沉淀
从而终止反应
而且在蛋白质
沉淀后
也便于我们测定上清液中酪氨酸
时不受蛋白质的干扰
所以我们要求的反应时间是10分钟
就是要求从酪蛋白的加入到三氯乙酸
的加入之间严格控制10分钟
实际操作中我们一般会做多个平行样品
减少误差
再加入底物的时候
应该在不同平行管间间隔5~10秒
并在加入终止试剂时也间隔相同
的时间
尽可能保证所有平行管中
的反应时间是一致的
除了对温度和时间的精确控制外
还有一个重要的问题
大家还记得我们学习分光光度法
的时候
需要用空白管去扣除一些
非待测物之外的事迹的影响
在酶的反应管中
除了生成的产物酪氨酸之外
是不是还有可能有其他影响测定的物质
比如说酶制剂
如果不够纯的话
会不会本身就含有游离氨基酸
结果被当成产物来计算和测定
再比如酶液本身就是蛋白质
或者含有其他蛋白质
再加入底物前温浴
的时候
有没有可能水解体系中的
蛋白质生成氨基酸产物
这些也都会被当做没反应的产物来计算
但它却不是在我们精确
计时的十分钟内产生的
怎么来扣除掉这些影响
请注意
在几乎所有酶反应测定的实验设计中
都需要设计对照管
用于扣除我们精确计时的酶反应时间
之外的底物减少或者产物增加
最常用的做法是在将底物加入对照管之前
使对照管中的酶
失去活性
然后再和测定管加入相同的
试剂进行
相同的操作
这样最后将测定管扣除对照管
就可以得到我们设计的反应
时间中底物的减少和产物的增加
让酶失活的方法通常是提前加入终止试剂
或者煮沸使酶失活
其中最常用的就是提前
加入终止试剂的方法
比如我们在菠萝蛋白酶活力的测定中
对照管的设计是在酶液温浴两分钟之后
加入酪蛋白之前
先加入三氯乙酸
使酶失去活性
然后再和测定管一起加入等量的酪蛋白
同时进行温浴
最后只在测定管中加入
终止试剂
这样的对照管设计
其体系中
加入各试剂的种类和
量与测定管完全一致
但是在10分钟的反应时间中
因为对照管的酶已经失活
所以没有酶学反应和产物生成
因此用测定管中的酪氨酸的量
减去对照管中酪氨酸的量
就可以精确的扣除10分钟
反应时间之外生成的产物
体系中原本含有的产物以及其他
试剂带来的吸光度影响
简单总结一下
当我们设计一个酶学反应的时候
主要需要注意考虑以下三个方面
第一
如何使反应体系
预先达成反应的温度和ph值
第二
如何实现酶反应时间的精确控制
第三
如何通过对照管的设计和
操作有效的扣除酶反应体系
对酶活力测定的影响
除了酶活力测定的部分之外
另一方面的工作就是测定
所生成的产物酪氨酸
我们需要配置一系列不同
浓度的酪氨酸标准曲线
然后与等体积的镁反应液上清
依次加入4毫升0.55摩尔每升的碳酸钠
再加入0.5毫升的Folin酚试剂
立即颠倒混匀
室温放置30分钟后
在680纳米处测定吸光度值
分别以酪氨酸的标准曲线浓度
和吸光度值为横纵坐标
绘制标准曲线
将酶的测定管吸光度值取平均
减去对照管中的吸光度值
计算生成的酪氨酸浓度
根据反应体系体积计算体系中
生成了多少微克的酪氨酸
进而计算体系中的酶活力单位关于计算
我们还会在后面的计算部分详细讲述
建议同学们先自行思考和练习计算过程
然后再跟我们进行对照
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试