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下一节:菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

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菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)课程教案、知识点、字幕

蛋白酶也称作蛋白水解酶和肽酶

是水解肽键的一类酶的总称

是所有生物生存必需的一类酶

蛋白酶在生物体的正常生命活动和

工业生产中都发挥着重要的作用

生物体内食品消化

蛋白循环 凝血级联系统

蛋白活化等诸多过程都需要蛋白酶的参与

而工业生产中食品加工

清洁医疗等领域也都有蛋白酶的身影

人体内很多蛋白酶本身就是

药物治疗的潜在靶点

因此说蛋白酶的活力测定作为研究

蛋白酶的基础具有重要的意义

不同的蛋白酶催化类型不同

现在通常分成6种

分别是丝氨酸型 苏氨酸型 半胱氨酸型

天冬氨酸型

谷氨酸型和金属型

蛋白酶的活性中心通常在分子

表面两个结构域之间的沟里

而沟的一侧或者两侧的结合

位点就决定了酶的特异性

大多数蛋白酶的活力测定方法是一致的

我们就以菠萝蛋白酶为例

学习蛋白酶活力测定的

实验原理和实验设计

菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶 无花果蛋白酶

动物组织蛋白酶等同属于

半胱氨酸型蛋白酶

指的是菠萝茎或者菠萝

果汁中的所有蛋白酶

一般存在于茎中的称为茎菠萝蛋白酶

提取自果肉的称为果菠萝蛋白酶

他们都是单链糖蛋白

菠萝蛋白酶在工业上有着广泛的应用

包括生物清洁剂 烘焙工业 

食品工业

化妆品工业

制药和医疗 饲料 酿酒工业

乳制品加工等等

所以对菠萝蛋白酶的测定

对其提纯 加工和使用都具有重要的意义

接下来我们就一起来学习

研究表明

菠萝蛋白酶的最适ph值在7左右

酶活力最高的温度在60度左右

我们在实际测定中

采用菠萝蛋白酶最适的

ph7的磷酸缓冲液

常用的蛋白酶测定温度为37度

在这个条件下加入酪蛋白底物

让菠萝蛋白酶水解酪蛋白

生成氨基酸混合物

其中生成的酪氨酸可以与

Folin酚试剂发生氧化还原反应

生成蓝色的钨蓝和钼蓝

蓝色物质的量与水解蛋白

所生成的酪氨酸的量成正比

通过测定680纳米处的

光吸收测定酪氨酸的生成量

并进而计算菠萝蛋白酶的活力

以每分钟水解酪蛋白生成一微克酪氨酸

所需要的酶量为一个活力单位

所以我们要做的就是让酶水解酪蛋白

然后测定体系中生成了多少酪氨酸

针对这个实验原理

我们需要完成两方面的工作

一是酶的水解反应

还有就是酪氨酸的测定

关于酶的水解反应

我们需要考虑反应体系的

ph值和温度的达成

以及酶促反应时间的精确控制

反应体系的达成

我们通过在体系中加入

适当的缓冲液来实现

温度则将试管在水浴锅里保温

因为反应时间是从酶和底物

接触开始到终止反应为止

所以我们需要提前将酶

和底物分别进行温浴

这样它们混合的时候才

不会导致温度的波动

需要注意的是

酶在水浴中可能会逐步失活

所以酶液温浴的时间要控制的尽可能短

而且要精确计时

确保不同批次的样品之间的可比性

将预热的酪蛋白加入到

ph7的酶液体系中

反应就开始了

从这一刻起就要

精确计时

直到反应终止

我们终止反应采用的是加入三氯乙酸

这是一种酸性的蛋白质

沉淀剂

会改变体系的ph值

并且使蛋白质沉淀

从而终止反应

而且在蛋白质

沉淀后

也便于我们测定上清液中酪氨酸

时不受蛋白质的干扰

所以我们要求的反应时间是10分钟

就是要求从酪蛋白的加入到三氯乙酸

的加入之间严格控制10分钟

实际操作中我们一般会做多个平行样品

减少误差

再加入底物的时候

应该在不同平行管间间隔5~10秒

并在加入终止试剂时也间隔相同

的时间

尽可能保证所有平行管中

的反应时间是一致的

除了对温度和时间的精确控制外

还有一个重要的问题

大家还记得我们学习分光光度法

的时候

需要用空白管去扣除一些

非待测物之外的事迹的影响

在酶的反应管中

除了生成的产物酪氨酸之外

是不是还有可能有其他影响测定的物质

比如说酶制剂

如果不够纯的话

会不会本身就含有游离氨基酸

结果被当成产物来计算和测定

再比如酶液本身就是蛋白质

或者含有其他蛋白质

再加入底物前温浴

的时候

有没有可能水解体系中的

蛋白质生成氨基酸产物

这些也都会被当做没反应的产物来计算

但它却不是在我们精确

计时的十分钟内产生的

怎么来扣除掉这些影响

请注意

在几乎所有酶反应测定的实验设计中

都需要设计对照管

用于扣除我们精确计时的酶反应时间

之外的底物减少或者产物增加

最常用的做法是在将底物加入对照管之前

使对照管中的酶

失去活性

然后再和测定管加入相同的

试剂进行

相同的操作

这样最后将测定管扣除对照管

就可以得到我们设计的反应

时间中底物的减少和产物的增加

让酶失活的方法通常是提前加入终止试剂

或者煮沸使酶失活

其中最常用的就是提前

加入终止试剂的方法

比如我们在菠萝蛋白酶活力的测定中

对照管的设计是在酶液温浴两分钟之后

加入酪蛋白之前

先加入三氯乙酸

使酶失去活性

然后再和测定管一起加入等量的酪蛋白

同时进行温浴

最后只在测定管中加入

终止试剂

这样的对照管设计

其体系中

加入各试剂的种类和

量与测定管完全一致

但是在10分钟的反应时间中

因为对照管的酶已经失活

所以没有酶学反应和产物生成

因此用测定管中的酪氨酸的量

减去对照管中酪氨酸的量

就可以精确的扣除10分钟

反应时间之外生成的产物

体系中原本含有的产物以及其他

试剂带来的吸光度影响

简单总结一下

当我们设计一个酶学反应的时候

主要需要注意考虑以下三个方面

第一

如何使反应体系

预先达成反应的温度和ph值

第二

如何实现酶反应时间的精确控制

第三

如何通过对照管的设计和

操作有效的扣除酶反应体系

对酶活力测定的影响

除了酶活力测定的部分之外

另一方面的工作就是测定

所生成的产物酪氨酸

我们需要配置一系列不同

浓度的酪氨酸标准曲线

然后与等体积的镁反应液上清

依次加入4毫升0.55摩尔每升的碳酸钠

再加入0.5毫升的Folin酚试剂

立即颠倒混匀

室温放置30分钟后

在680纳米处测定吸光度值

分别以酪氨酸的标准曲线浓度

和吸光度值为横纵坐标

绘制标准曲线

将酶的测定管吸光度值取平均

减去对照管中的吸光度值

计算生成的酪氨酸浓度

根据反应体系体积计算体系中

生成了多少微克的酪氨酸

进而计算体系中的酶活力单位关于计算

我们还会在后面的计算部分详细讲述

建议同学们先自行思考和练习计算过程

然后再跟我们进行对照

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

--离子交换层析

--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)笔记与讨论

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