当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > 蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀
依据溶解度进行蛋白质分离纯化的技术包括盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等。上一个视频我们了解了盐析和盐析操作的注意事项。今天我将介绍有机溶剂沉淀和蛋白质等电点沉淀。
利用要分离的物质和其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同,通过添加一定量的特定有机溶剂,使某种物质沉淀析出,从而与其他组分分离的方法,被称为有机溶剂沉淀法。
谈到有机溶剂沉淀就一定会涉及到介电常数。
介电常数是由物质的属性决定的。例如20℃时,丙酮的介电常数是21.4,而水的介电常数是80。如图所示,分母中的ε就是介电常数,可以看出,随着ε的减小,带电分子之间的相互作用力F会增加。
有机溶剂引起蛋白质沉淀主要原因是降低了蛋白质溶液的介电常数。溶液介电常数的降低会增强蛋白质分子之间的相互作用,而使其聚集沉淀。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一个原因与盐析相似,有机溶剂能够与蛋白质直接争夺溶液中的水分子,导致蛋白质分子水化膜被破坏,分子之间互作增强,聚集沉淀。
常用的有机溶剂有甲醇、乙醇和丙酮,它们能够与水互溶,能够显著降低蛋白质在水中的溶解度。但是,注意在室温下,有机溶剂在降低蛋白质溶解度的同时,还会引发蛋白质的变性沉淀。
丙酮是有机溶剂,在蛋白质分离纯化过程中,常用来沉淀蛋白质。此外,丙酮还有去除蛋白质提取过程中的色素、膜脂等杂质的作用。但是值得注意的是,为了防止蛋白质变性沉淀的发生,在进行丙酮沉淀蛋白质的操作时,丙酮一定要预先冷冻处理。
此外其他物质也能够沉淀蛋白质,例如,聚乙二醇。聚乙二醇 (PEG:polyethylene glycol),具有脱去蛋白质表面的水化层,浓缩蛋白质的作用。
下面我将介绍另外一种改变溶解度沉淀蛋白质的方法,等电点沉淀法。
蛋白质是带有正负电荷的两性电解质,其带电基团的数量和性质随着蛋白质溶液的pH值不同而发生变化。当某种蛋白质净电荷为零时,此时蛋白质溶液的pH值就是该蛋白质的等电点,用pI 表示。(图片组合出现)
通常在pI值下,蛋白质在溶液中的溶解度最低。(图片组合出现)研究人员可以利用蛋白质在其等电点溶解度最低这一性质来分离纯化目标蛋白。当蛋白溶液的pH值达到目标蛋白等电点时,该蛋白质分子由于净电荷为零,导致蛋白质分子静电排斥力降低,致使它们之间的相互作用达到最强,从而形成聚集体从溶液中沉淀下来。
那什么时候选用等电点沉淀方法进行蛋白质分离纯化呢?
实际上当目标蛋白的等电点与蛋白提取缓冲液的pH相差很大时,用等电点沉淀目标蛋白是比较容易成功的。
这里再次强调:
Ø 当蛋白质溶液pH值小于其等电点时,蛋白质带正电。
Ø 当蛋白质溶液pH值等于其等电点pI 时,蛋白质净电荷为零,溶解度最低。
Ø 当蛋白质溶液pH值大于其等电点时,蛋白质带负电。
例如碱性蛋白质溶菌酶(等电点为11),在酸性条件下或者是低pH条件带正电,呈现溶解状态,而在高pH条件下,达到等电点时发生沉淀。而酸性蛋白质与之相反,以卵清蛋白为例,其等电点是4.6,在碱性条件下,即高pH条件下,该蛋白质带负电,呈现溶解状态;在低pH条件,假如pH为4.6,则蛋白质发生沉淀。
相信你听说过牛乳经济掺假的事情吧?
所谓牛乳经济掺假通常是指在牛乳中掺入廉价的组分,除了有毒化工原料三聚氰胺外,主要的经济掺假蛋白原料包括乳清粉、明胶和大豆分离蛋白粉等。
如何判断是否牛乳经济掺假呢?
是否可以考虑测定牛乳中的特定蛋白组分,依据该组分的含量来判定呢?
有文献报道:可以用牛乳中的酪蛋白含量来判定经济掺假。通常酪蛋白在牛乳乳蛋白中的占比维持在77%~78%,因此酪蛋白可以作为牛乳中特征成分进行检测。
那又如何测定牛乳中酪蛋白的含量呢?
可以利用等电点沉淀法
牛乳蛋白质主要包括酪蛋白和乳清蛋白。酪蛋白的等电点是4.6
正常牛乳的pH值为6.6~6.8,因此酪蛋白胶粒在牛乳中以负电荷的形式存在,在牛乳中加入酸性物质,调节pH达到酪蛋白等电点,此时酪蛋白以及夹杂物就会以沉淀的形式析出,通过离心分离获得酪蛋白沉淀粗品。再通过其他方法将酪蛋白和杂质分开,最后即可得到纯品的酪蛋白。
研究人员在《酪蛋白沉淀检测方法及其在牛乳经济掺假鉴定中的应用》一文中,描述了等电点沉淀法提取酪蛋白的过程。
从图中可以看出,在烧杯中有100mL牛乳,溶液pH值为6.6~6.8,可以加入10%的醋酸溶液,调节烧杯中牛乳溶液pH值为4.6。当蛋白质沉淀后,将烧杯中溶液转入离心管中,3000rpm离心15min。离心管中的沉淀即为酪蛋白粗品。之后可以通过应用其他技术获得纯品酪蛋白。
文献指出,从理论上讲,可以将酪蛋白
质量分数≥73%,作为牛乳掺假检验的定量指标。
从文章的检验结果可知,酪蛋白等电点沉淀法能够有效检测出牛乳中乳清粉和明胶的掺假行为,但是无法准确检测出蛋白粉的掺假行为。
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