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蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀资料文件与下载

蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

依据溶解度进行蛋白质分离纯化的技术包括盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等。上一个视频我们了解了盐析和盐析操作的注意事项。今天我将介绍有机溶剂沉淀和蛋白质等电点沉淀。

利用要分离的物质和其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同,通过添加一定量的特定有机溶剂,使某种物质沉淀析出,从而与其他组分分离的方法,被称为有机溶剂沉淀法。

谈到有机溶剂沉淀就一定会涉及到介电常数。

介电常数是由物质的属性决定的。例如20℃时,丙酮的介电常数是21.4,而水的介电常数是80。如图所示分母中的ε就是介电常数,可以看出,随着ε的减小,带电分子之间的相互作用力F会增加。

有机溶剂引起蛋白质沉淀主要原因是降低了蛋白质溶液的介电常数。溶液介电常数的降低会增强蛋白质分子之间的相互作用,而使其聚集沉淀。

有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一个原因与盐析相似,有机溶剂能够与蛋白质直接争夺溶液中的水分子,导致蛋白质分子水化膜被破坏,分子之间互作增强,聚集沉淀。

常用的有机溶剂有甲醇、乙醇和丙酮,它们能够与水互溶,能够显著降低蛋白质在水中的溶解度。但是,注意在室温下,有机溶剂在降低蛋白质溶解度的同时,还会引发蛋白质的变性沉淀。

丙酮是有机溶剂,在蛋白质分离纯化过程中,常用来沉淀蛋白质。此外,丙酮还有去除蛋白质提取过程中的色素、膜脂等杂质的作用。但是值得注意的是,为了防止蛋白质变性沉淀的发生,在进行丙酮沉淀蛋白质的操作时,丙酮一定要预先冷冻处理。

此外其他物质也能够沉淀蛋白质,例如,聚乙二醇。聚乙二醇 (PEG:polyethylene glycol),具有脱去蛋白质表面的水化层,浓缩蛋白质的作用。

下面我将介绍另外一种改变溶解度沉淀蛋白质的方法,等电点沉淀法。

蛋白质是带有正负电荷的两性电解质,其带电基团的数量和性质随着蛋白质溶液的pH值不同而发生变化。当某种蛋白质净电荷为零时,此时蛋白质溶液的pH值就是该蛋白质的等电点,用pI 表示。(图片组合出现)

通常在pI值下,蛋白质在溶液中的溶解度最低。(图片组合出现)研究人员可以利用蛋白质在其等电点溶解度最低这一性质来分离纯化目标蛋白。当蛋白溶液的pH值达到目标蛋白等电点时,该蛋白质分子由于净电荷为零,导致蛋白质分子静电排斥力降低,致使它们之间的相互作用达到最强,从而形成聚集体从溶液中沉淀下来。

那什么时候选用等电点沉淀方法进行蛋白质分离纯化呢?

实际上当目标蛋白的等电点与蛋白提取缓冲液的pH相差很大时,用等电点沉淀目标蛋白是比较容易成功的。

这里再次强调:

Ø 当蛋白质溶液pH值小于其等电点时,蛋白质带正电。

Ø 当蛋白质溶液pH值等于其等电点pI 时,蛋白质净电荷为零,溶解度最低。

Ø 当蛋白质溶液pH大于其等电点时,蛋白质带负电。

例如碱性蛋白质溶菌酶(等电点为11),在酸性条件下或者是低pH条件带正电,呈现溶解状态,而在高pH条件下,达到等电点时发生沉淀。而酸性蛋白质与之相反,以卵清蛋白为例,其等电点是4.6,在碱性条件下,即高pH条件下,该蛋白质带负电,呈现溶解状态;在低pH条件,假如pH为4.6,则蛋白质发生沉淀。

相信你听说过牛乳经济掺假的事情吧?

所谓牛乳经济掺假通常是指在牛乳中掺入廉价的组分,除了有毒化工原料三聚氰胺外,主要的经济掺假蛋白原料包括乳清粉、明胶和大豆分离蛋白粉等。

如何判断是否牛乳经济掺假呢?

是否可以考虑测定牛乳中的特定蛋白组分,依据该组分的含量来判定呢?

有文献报道:可以用牛乳中的酪蛋白含量来判定经济掺假。通常酪蛋白在牛乳乳蛋白中的占比维持在77%~78%,因此酪蛋白可以作为牛乳中特征成分进行检测。

那又如何测定牛乳中酪蛋白的含量呢?

可以利用等电点沉淀法

牛乳蛋白质主要包括酪蛋白和乳清蛋白。酪蛋白的等电点是4.6

正常牛乳的pH值为6.6~6.8,因此酪蛋白胶粒在牛乳中以负电荷的形式存在,在牛乳中加入酸性物质,调节pH达到酪蛋白等电点,此时酪蛋白以及夹杂物就会以沉淀的形式析出,通过离心分离获得酪蛋白沉淀粗品。再通过其他方法将酪蛋白和杂质分开,最后即可得到纯品的酪蛋白。

研究人员在《酪蛋白沉淀检测方法及其在牛乳经济掺假鉴定中的应用》一文中,描述了等电点沉淀法提取酪蛋白的过程。

从图中可以看出,在烧杯中有100mL牛乳,溶液pH值为6.6~6.8,可以加入10%的醋酸溶液,调节烧杯中牛乳溶液pH值为4.6。当蛋白质沉淀后,将烧杯中溶液转入离心管中,3000rpm离心15min。离心管中的沉淀即为酪蛋白粗品。之后可以通过应用其他技术获得纯品酪蛋白。

文献指出,从理论上讲,可以将酪蛋白

质量分数≥73%,作为牛乳掺假检验的定量指标。

从文章的检验结果可知,酪蛋白等电点沉淀法能够有效检测出牛乳中乳清粉和明胶的掺假行为,但是无法准确检测出蛋白粉的掺假行为。

 


下一节:离子交换层析

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基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

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-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

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--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

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--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀笔记与讨论

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