当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第四章 酶活力的测定 > 第三节 酶米氏常数的测定 > 菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)
顺利完成菠萝蛋白酶
米氏常数的测定实验后
我们得到了一系列的实验数据
而且同学们已经学习过双倒数作图法
计算米氏常数的思路和注意事项
所以请你自己练习一下
用这组数据计算菠萝蛋白酶的米氏常数
KM值
接下来我们一起来看看你的计算过程
和结果跟我们的计算过程是否一致
米氏方程双倒数作图的公式是这样的
所以我们需要用S分之一为横坐标
以V分之1为纵坐标来作图
我们要分别计算出每支酶反应
管中的底物浓度和反应速度
我们先来计算每支酶反应管里的反应速度
也就是每一支管中每分钟
生成酪氨酸的浓度
这就要知道个管中的酪氨酸浓度
所以第1步先要计算酪氨酸
标准曲线的浓度
绘制酪氨酸浓度的标准曲线
接下来计算不同底物浓度的酶反应管中
在酶促反应时间里生成产物的吸光度
也就是用个测定管的吸光度
值减去空白管的吸光度值
利用酪氨酸浓度的标准曲线拟合方程
计算出各酶反应管中生成的酪氨酸浓度
接下来我们需要计算各个
酶反应管中的反应速度
反应速度应该是每分钟生成酪氨酸的浓度
所以请注意
这里最关键的问题是计算的是
哪个体系中的酪氨酸浓度
是缓冲液加酪蛋白
加酶液的两毫升体系
还是缓冲液加酪蛋白加酶液加
三氯乙酸的3毫升体系中吗
我们在前面的学习中已经详细讨论过
应该是计算缓冲液加
酪蛋白加酶液的酶反应体系
也就是两毫升体系中的酪氨酸浓度
而我们现在算出的这些酪氨酸浓度
是缓冲液加酪蛋白加酶液加三氯乙酸
的3毫升测定体系中的酪氨酸浓度
因此这些数值还需要乘以除以2
换算成两毫升的
酶反应体系中的浓度
并除以反应时间10分钟
得出各酶反应管的反应速度
并进而计算出各管中的1/v
此时我们还需要知道各酶
反应管中的底物浓度
浓度的计算步骤很简单
不过需要确定的是底物浓度
不是初始加入的底物浓度
而是两毫升的酶反应体系中的底物浓度
所以我们需要将初始加入底物的体积
乘以10毫克每毫升的浓度
再除以两毫升的酶反应体系体积
计算出各酶促反应管中的底物浓度S
并进而计算出1/S
然后以1/S为横坐标
以1/v为纵坐标绘制双倒数图
我们知道米氏方程可以写成
这种双倒数的形式
我们以1/S为横坐标
以1/v为纵坐标
绘制的曲线斜率就等于KM/Vmax
而曲线的纵截距就为1/Vmax
所以我们的拟合方程中截距
34.139=1/Vmax
由此就可以计算出Vmax等于1除以截距
等于0.029毫克每毫升每分钟
而KM就等于斜率除以截距
就等于178.02÷34.139
等于5.215毫克每毫升
好了
计算完了和你算的一样吗
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