蛋白质的超速离心、透析和超滤慕课视频播放-基础生物化学实验-MOOC慕课视频教程-柠檬大学

依据蛋白质大小进行分离纯化的技术包括超速离心、透析、超滤和凝胶过滤层析等。这个视频我将要向大家简单介绍超速离心、透析和超滤。

超速离心是20世纪20年代由瑞典科学家Swedberg发明的，其原理是根据不同分子量的蛋白质在超速离心力场下的沉降速度不同而进行蛋白质分离纯化的技术。

在前面的视频中有关离心技术的内容已经有所介绍，这里就不在赘述了。

你可以通过离心手段获得你想要的蛋白质。如果你想研究的蛋白质属于特定的细胞器，那么你也可以通过超速离心的方法先获得相应的细胞器，之后再进行蛋白质功能的研究或者分离提取。假如，你想研究细胞核中的蛋白质，如图所示，你就可以先用超速离心的方法获得细胞核。

下面以“川芎嗪对大鼠缺血心肌细胞核钙转运异常的影响”文献为例，研究人员以正常组、缺血组以及川芎嗪保护组大鼠的心脏组织为研究材料，拟通过测定心脏组织细胞核膜上的Ca²⁺ -ATP酶活性等指标来研究川芎嗪对大鼠缺血心肌细胞核钙转运异常的影响。他们采用了超速离心的技术在11000g下离心60min，获得了大鼠心脏细胞的细胞核，之后对核膜上的Ca²⁺ -ATP酶活性进行了测定。

由于超速离心需要超速离心机，目前在蛋白质的分离制备上已经不太使用。相对使用较多的是密度梯度离心。这里不做介绍。

在生物大分子的分离纯化过程中，常常会用到透析进行除盐、或者浓缩样品。

那什么是透析呢？

谈到透析，就得先说说透析袋。透析袋是用半透膜做成的袋子，半透膜可以用动物膜和玻璃纸制作或者纤维素制作。商品化的透析袋通常制作成扁平管状，其扁平宽度为6 mm～50 mm不等。

以盐析后蛋白质样品为例，透析就是将蛋白样品混合物溶液装入透析袋内，再将透析袋浸入透析缓冲液，也就透析液中。由于透析袋在溶液中溶胀，能够使样品溶液中小于膜孔径的盐，例如硫酸铵和其他小分子物质不断在浓度梯度的驱动下扩散到透析袋外，直至透析袋内外小分子物质浓度一致，而大分子诸如蛋白质分子被截留在袋内。

如果透析一定时间后，当更换浸泡透析袋的透析液后，透析过程将重新开始，经过多次更换透析液，理论上就能够完全去除透析袋内蛋白质样品中的小分子物质。

让我们一起来看看透析操作的一些注意事项

首先看透析袋的预处理：

为了防止透析袋干裂，商品透析袋在出厂时通常用10%的甘油处理，由于透析袋含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，这些杂质将对蛋白质和其它具有生物活性的物质产生毒害作用。因此，透析袋在使用前一定要进行预处理。

一般在使用前，先将透析袋浸泡在去离子水中，之后用去离子水多次冲洗透析袋。为了去除透析袋上可能存在的微量硫化物和重金属等物质，可依次用50%乙醇、0.01 mol/L的碳酸氢钠溶液、 0.001 mol/L 的EDTA溶液依次浸泡洗涤，最后用去离子水冲洗。

之后要进行透析袋密封性检查

将透析袋一端用橡皮筋、或者线绳，或者特制的透析袋夹扎紧。由另一端灌满去离子水或者蒸馏水，用手指轻轻按压透析袋，检查是否有漏液情况。

之后就可以加样品进行透析了。

在向透析袋中加入样品时，需要留出一定的空间，样品溶液体积最好控制在透析袋体积的三分之二左右，因为透析过程中透析缓冲液会进入透析袋，引发透析袋内溶液体积增加过量而导致透析袋破裂。如果透析过夜的话，加样体积最好控制在透析袋体积的二分之一左右。

那透析液体积大约是多少呢？透析时，透析液体积通常是透析袋样品体积的100倍以上就可以。

通常情况下，在持续透析的过程中，透析液至少要全部更换至少3次，一般每2小时以上就更换一次，也可间隔更长时间，而且最后一次透析时间一定要超过2小时。有时透析操作还需要过夜。

透析时的温度主要取决于样品，为了保证蛋白质的活性，通常情况在4℃下透析。

为了加快透析速度，提高透析效率，除及时更换透析液外，还可使用磁力搅拌，如图片所示。

透析袋使用后如何处理呢？

通常是用去离子水或者蒸馏水多次冲洗，之后4℃保存在50%的乙醇中。为了防止微生物污染，也可加入0.05-0.1%的叠氮化钠。

下面我将继续介绍超滤。什么是超滤呢？

人们将待分离的样品混合物装入具有特定滤膜的装置，在给予一定压力的条件下，混合物样品中某些组分能够透过滤膜，剩余的组分被截留，混合物得到一定程度的分离，这种方法就是超滤。

超滤膜是超滤装置的核心组件。超滤膜一般由纤维素或者再生纤维素等材料制成。实验室常用的超滤装置是超滤管。不同型号超滤管配备的滤膜截留物质的相对分子量不同。超滤膜截留的颗粒直径为2～200nm，相当于分子量1000 ～5ｘ10⁵ Da，主要用于分离病毒和各种生物大分子。

表格显示的是 Amicon® Ultra离心超滤管的部分信息，表格右边的那列数字显示的是截留的相对分子量。

超滤管拆开有外管、内管和管盖。从超滤管的上部垂直观察，可以看到内管内部及超滤膜。

搞清楚超滤管的结构，超滤原理，下面让我们一起选择一下超滤管的型号吧。

假如你这里有一个蛋白样品的混合物，你的目标蛋白质分子量是120KD，那么你将选用上述表格中的那种型号呢？

先看看表格中超滤管的信息，可以决定了吧？

对，选用UFC510096。因为这个型号的滤膜截留分子分子量为100KD，通过将样品混合液加入超滤管，离心，目标蛋白和大于100KD的蛋白质将留在内管中，其他杂蛋白则进入外管。收集内管蛋白溶液就达到部分分离的目的。

超滤除了对蛋白质进行粗略的分离外，更重要的是用于蛋白质的浓缩。相对于透析而言，超滤管浓缩蛋白质溶液，简便，省时。

你可以想象一下，除了上面的用途，超滤还有什么应用呢？这里举一个例子，你会发现，超滤还有如此用途。

这里有一篇文献，题目是超滤技术在制药行业中的应用。你看他们是如何运用超滤技术呢？他们是想获得中药及其复方的有效成分，例如分子量都较小的生物碱、黄酮类、苷类等，而去除分子量较大，结构复杂的蛋白、鞣质、树脂、淀粉等无效成分。他们通过选择合适的超滤膜，截留目标成分，从而减少中药中的无效成分，减小未经超滤处理的中药服用量，这种超滤处理也可增加中药制剂的稳定性。

在这里，我向大家提一个问题。针对上述中药制药的文献，如果我用超滤管进行毫升数量级的物质分离时，那么中药中的有效成分是留在超滤管的内管还是外管呢？

对，有效成分在外管！因为这次需要的是小分子物质，超滤膜无法截留这些物质，这些物质在离心过程中进入外管。内管截留的是一些蛋白质、脂类等杂质，是无效成分。