当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第一节 蛋白质的定量测定 > 双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算
我们按照实验指导的步骤制作标准曲线,并和未知浓度样品一起与双缩脲试剂发生反应后,就得到了540nm下的一系列吸光度值:
首先绘制标准曲线,这里有个问题:我们在配制好标准曲线后,蛋白质溶液体积是1ml,加入双缩脲试剂后,总体积变成5ml,那么,我们计算蛋白质浓度的体系应该是1ml还是5ml呢?
两种体系下计算出的标准曲线蛋白质浓度显然是不同的,你会如何选择呢?
请注意:标准曲线法测定和计算未知样品浓度时,主要是让未知样品的吸光度值和标准曲线的吸光度值进行比较,然后按比例计算出未知样品的浓度。所以我们需要知道的是样品的吸光度落在标准曲线的什么位置。
那么样品吸光度在标准曲线的位置是什么时候确定的呢?其实,在我们配制好标准曲线和样品,加入双缩脲试剂之前,浓度就已经确定,样品的浓度在标准曲线的什么位置也已经固定,后面加入等体积的反应试剂,只会使所有管的浓度按比例变化,并不影响未知浓度样品落在标准曲线的位置,也同样不会影响未知样品浓度的计算。
所以,对于需要发生反应生成有颜色产物再进行测定的实验来说,都是以最初配制的标准曲线浓度为横坐标,以吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,而与加入反应试剂的体积没有关系。在本次双缩脲法测定蛋白质浓度的实验中,我们以1ml标准曲线的浓度为横坐标,以每管吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
请注意,完整的标准曲线需要有图名、横纵坐标的说明、单位、波长等信息,方便别人查看。
然后将未知样品多个平行样的吸光度值取平均值,根据拟合方程,计算出未知样品浓度
x = (0.469 - 0.0025)÷ 0.0733 = 6.364 mg/ml
如果前期样品有稀释的话,需要计算稀释倍数,将6.364乘以稀释倍数,即可得到原始样品液中的蛋白质浓度。
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