当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第二章 生命科学三大必备仪器的使用 > 第五节 分光光度法测定待测物浓度 > 分光光度法的原理
我们在前面介绍分光
光度计用法的时候
就已经介绍过分光光度
法的理论基础
朗伯比尔定律
大家还记得这个定律的内容吗
当一束平行单色光通过均匀的溶液时
此溶液在一定范围内吸光度A
与吸光物质的浓度C以及液层的厚度L
成正比用公式表示就可以写成A等于ECL
其中A表示吸光度E为常数
C为浓度
L为光程
光程有时候也用小写的b表示
因为吸光度一般用分光光度计测定
其光程由比色杯来框定
是一个固定的值
所以这个公式可以把
E和L都看作常数
就可以简化为吸光度
A和物质的浓度C
成正比
利用这个关系
当我们想知道溶液中某种
物质含量的时候
只需要通过测定已知浓度
的标准品的吸光度值
求出A和C之间的系数关系
然后再通过测定未知浓度
样品的吸光度值
就可以计算出未知样品中的浓度
C的值
这就是我们在物质定量测定
中最常用到的分光
光度法的基本原理
实际工作中我们需要测定的物质
有的本身有光吸收
有的本身没有光吸收
对于本身有关吸收的物质
来说相对比较简单
一般选择其光吸收最大的波长
直接进行测定即可
比如说在280纳米处
测定蛋白质的浓度
或者是在260纳米
处测定核酸的浓度
而对于本身没有光吸收的物质来说
则需要加入显色溶液或者染色溶液
使其生成有光吸收的物质再进行测定
比如我们知道葡萄糖在紫外区
和可见区都没有光吸收
但是我们可以通过葡萄糖和显色试剂
352硝基水杨酸发生反应
等比例的生成红色的
三氨基五硝基水杨酸
然后通过测定红色产物的浓度
来推测葡萄糖的浓度
又比如说蛋白质在可见光
区没有光吸收
我们除了可以用Folin-酚试剂等显
色剂在可见光区进行测定外
还可以通过加入考马斯亮蓝
G250染色剂使其在595
纳米的可见光区产生光吸收
从而测定其浓度
显色剂或者染色剂的加入
常常可以提高物质测定
的灵敏度和准确度
所以也经常被采用
这些方法我们在后面还会详细学习
到时候同学们可以把多种
方法进行比较和讨论
总之分光光度法是一种灵敏度很高
操作简便的方法
因此是生命科学领域物质
测定中最常用的方法
下一节中
我们将学习分光光度法
测定物质浓度的实验设计
思路和操作注意事项
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试



