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菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

1.     顺利完成了菠萝蛋白酶米氏常数的测定实验后，我们得到了一系列的实验数据，

菠萝Km算1.png

而且同学们已经学习过双倒数作图法计算米氏常数KM的思路和注意事项，所以请你自己练习用这组数据计算一下菠萝蛋白酶的米氏常数KM。接下来，我们一起来看看，你的计算过程和结果与我们的计算过程是否一致吧。
米氏方程双倒数作图的公式是

菠萝Km算2.png

需要用1/[S]为横坐标，以1/v为纵坐标作图，所以我们要分别计算每支酶反应管里的底物浓度[S]和反应速度v。

2.     我们先来计算每支酶反应管里的反应速度，也就是每支管中每分钟生成酪氨酸的浓度，要知道各管中的酪氨酸的浓度，第一步，先要计算酪氨酸标准曲线浓度

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3.     绘制酪氨酸浓度标准曲线

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4.     接下来，计算不同底物浓度的酶反应管中在酶促反应时间生成的产物吸光度，也就是用各测定管的吸光度值减去空白管的吸光度值。

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5.     利用酪氨酸浓度标准曲线的拟合方程，计算出各酶反应管中生成的酪氨酸浓度

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6.     接下来，我们需要计算各酶反应管中的反应速度，反应速度应该是每分钟生成酪氨酸的浓度，请注意，这里关键的问题是，计算哪个体系中的酪氨酸浓度？
是缓冲液+酪蛋白+酶液的2 ml体系，还是缓冲液+酪蛋白+酶液+三氯乙酸的3 ml体系呢？

菠萝Km算7.png

我们在前面的学习中已经详细讨论过，应该计算缓冲液+酪蛋白+酶液的“酶反应体系”，也就是2ml体系中的酪氨酸浓度。

7.     而我们现在算出的这些酪氨酸浓度是缓冲液+酪蛋白+酶液+三氯乙酸的3 ml“测定体系”中的酪氨酸浓度，所以这些数值还需要乘以3/2，换算成2 ml“酶反应体系”中的浓度，并除以反应时间10 min，得出各酶反应管的反应速度，并进而计算出各管中的1/v。

菠萝Km算8.png

8.     此时，我们还需要各酶反应管中的底物浓度，浓度计算的步骤很简单，不过需要确定的是，这个底物浓度不是初始加入的底物浓度，而是2 ml“酶反应体系”中的底物浓度，所以我们需要将初始加入底物的体积乘以10 mg/ml的浓度，再除以2 ml酶反应体系体积，即可得到各酶促反应管中底物的浓度[S]，进而计算出1/[S]。

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9.     以1/[S]为横坐标，以1/v为纵坐标，绘制双倒数图

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10.  我们知道，米氏方程可以写成这种双倒数的形式

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我们以1/[S]为横坐标，以1/v为纵坐标绘制的曲线其斜率就等于KM/Vmax，而曲线的纵截距即为1/Vmax，所以，我们的拟合方程中截距34.139 = 1/Vmax，
由此可以计算出Vmax = 1÷截距 = 1/34.139 = 0.029 mg/ml·min，

KM = 斜率÷截距 = 178.02 ÷ 34.139 = 5.215 mg/ml。

11.  好了，计算完了，和你算的一样吗？


下一节:查阅一个你感兴趣的酶，想想怎么测？

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基础生物化学实验课程列表：

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么？

--《生物化学实验》学什么？

--《生物化学实验》学什么？

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习？

--不同需求的同学如何学习本课程？

--不同需求的同学如何学习本课程？

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素（VB2）荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗？

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶比活力的测定（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力的计算（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力的计算（Folin酚法）

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

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--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作（Folin酚法）

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--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

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-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶，想想怎么测？

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

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--拟南芥叶片基因组DNA提取

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--紫外分光光度法测定核酸

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子，如何纯化呢？

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳，还有什么用于生物大分子鉴定的方法？

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）笔记与讨论

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