当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第三节 其他物质的测定 > 核黄素(VB2)荧光光度定量测定法
核黄素,也称为维生素B2,是一种存在于食物中的维生素,鸡蛋,绿色蔬菜,牛奶,肉类,蘑菇和杏仁中都含有核黄素。核黄素于1920年被发现,于1933年被分离出来,并于1935年首次合成。它被列入世界卫生组织的基本药物清单,是目前认为最有效和最安全的药物之一。
核黄素在水及酒精的中性溶液中为黄色,有很强的荧光,这种荧光在强酸或强碱中易破坏。从荧光光谱图可以看出,核黄素激发光波长范围较宽,一般定为460nm左右,发射光波长范围约为510-550nm,一般定为520nm左右。利用核黄素在稀溶液中荧光强度与核黄素浓度成正比的特性可进行核黄素的定量测定。
用30mM的醋酸溶液,溶解核黄素标准品,配制成10μg/mL的标准核黄素溶液,按下表配制标准曲线,其中0号管不含有核黄素,将作为空白管用于调节仪器零点。
接下来我们使用”棱光”牌F95S荧光分光光度计测定核黄素标准曲线和未知样品的光吸收
核黄素的激发光谱在460左右,所以请先安装465nm的激发光源。开机预热30分钟,调节波长至待测物的发射光波长520nm,在控制面板按1选择荧光值档位,将标准曲线浓度最高的样品倒入比色杯,检查杯壁无污渍,因为荧光分光光度计激发光和发射光的光路成90°,所以需要使用4面透光的比色杯,因此我们拿取比色杯的时候需要注意不要直接手持光面,请手持边棱或顶部,
将此样品放入比色池,关上样品池盖,按一下“归一”键,面板右上角显示1,这是灵敏度,再按归一键,右上角显示2,此时样品荧光强度在116左右,我们就可以采用此灵敏度来进行所有样品的测定。
取出样品管,放入空白管,盖上样品池盖,按“调零”键,荧光强度值显示为0,接下来依次放入待测定的所有样品并记录荧光强度值。
需要注意的是,荧光比色杯重复使用时务必先用去离子水彻底清洗多次,每次尽量去掉残余液体,然后再倒入待测样品进行润洗,润洗的操作同样是倒入少量液体,倾斜比色杯使液体流经各个内壁,将润洗液倒掉,润洗2-3次彻底去除残余液体的影响,再加入待测液,放入样品池,盖上样品池盖,记录荧光强度值。测定结束后,关机。
以标准曲线核黄素浓度为横坐标,以荧光强度值为纵坐标,绘制标准曲线,根据标准曲线方程,计算待测物浓度。
注意,核黄素的荧光会被日光淬灭,操作过程中需注意避光。
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