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淀粉酶米氏常数测定的实验指导资料文件与下载

淀粉酶米氏常数测定的实验指导

淀粉酶米氏常数测定的实验指导

一、          实验试剂

1.       pH 5.6的柠檬缓冲液（0.1 M）：5.5 g柠檬酸(C6H8O7，Mw 192.13)，21.3 g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O，Mw 294.1)，溶解并定容在1 L纯水中。

2.       3, 5-二硝基水扬酸溶液(3,5-Dinitrosalicylic acid，C7H4N2O7，Mw 228.12)：
称取3, 5-二硝基水扬酸1 g, 溶于20 ml 1 M NaOH中, 加入50 ml纯水, 再加入30 g酒石酸钾钠，溶解后用纯水稀释定容至100 ml，盖紧瓶塞勿使二氧化碳进入。

3.       10 mg/ml淀粉：称取1 g可溶性淀粉, 加入约80 ml pH 5.6的柠檬缓冲液（0.1 M），加热溶解，冷却后定容到100 ml。

4.       1 mg/ml麦芽糖标准液：称取1 g麦芽糖，用纯水溶解并定容到1 L。

5.       0.4 M NaOH：称取1.6 g NaOH，用纯水溶解并定容到100 ml。

6.       4 U/ml α-淀粉酶（Sigma，10065-10G，30U/mg，来源于米曲霉）

二、          实验器材

移液器、可见分光光度计（含比色杯）、恒温水浴锅

三、          实验步骤

1.  淀粉酶活力测定

取11支试管，按下表加入柠檬酸缓冲液和淀粉溶液，温浴5 min后，先在对照管中加入4ml NaOH，然后在每管加入1 ml温浴到40℃的淀粉酶，注意各管之间间隔一定时间，精确控制反应时间5 min，然后各酶反应管中加入0.4 M NaOH 4 ml终止反应，注意加入NaOH的时间间隔要与加入酶液的时间间隔一致。 反应结束，从每管中取出1ml上清，转移到新的试管中，进行麦芽糖浓度测定。

淀粉酶实验指导1.png

2.       麦芽糖标准曲线绘制
按下表配制麦芽糖标准曲线，在标准曲线和转移了1 ml酶反应液的每支试管中，各加入1 ml 3,5-二硝基水杨酸，所有试管一起放入沸水浴煮沸5 min，冷却后定容到15 ml。在520 nm处测定各管吸光度值。

淀粉酶实验指导2.png

3.       绘制麦芽糖标准曲线，计算各管中的酶反应速度，双倒数作图法计算α-淀粉酶的米氏常数KM值。

 

 


下一节:菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作（Folin酚法）

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基础生物化学实验课程列表：

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么？

--《生物化学实验》学什么？

--《生物化学实验》学什么？

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习？

--不同需求的同学如何学习本课程？

--不同需求的同学如何学习本课程？

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素（VB2）荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗？

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶比活力的测定（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力的计算（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶活力的计算（Folin酚法）

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶，想想怎么测？

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

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--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

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--拟南芥叶片基因组DNA提取

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--紫外分光光度法测定核酸

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子，如何纯化呢？

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

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--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳，还有什么用于生物大分子鉴定的方法？

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

淀粉酶米氏常数测定的实验指导笔记与讨论

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