当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > 盐析操作注意事项
同学们大家好
在之前的视频中你们
学习了盐析的原理
这个视频我将介绍盐析
的操作及注意事项
那么进行盐析操作时
加入的中性盐有哪些呢
常见的有硫酸铵硫酸钾
硫酸钠和氯化钠等等
在分离纯化过程中
硫酸铵使用最为普遍
原因在于硫酸铵作为中性盐
具有以下优点
溶解性高 温度系数小
如表格所示
即便是在0℃下都可达到每升溶液
能够溶解697g 固体硫酸铵
其次硫酸铵便宜
而且在条件适合时使用硫酸铵沉淀
蛋白还不会引起蛋白质变性
该方法能够有效维持蛋白质的活性
第三
硫酸铵是二价离子
同样浓度下比氯化钠离子强度更高
更容易导致蛋白质发生沉淀
因此在实验操作中是大家
普遍选择的中性盐
由于氯化钠相对比较便宜
常用于工业化生产
在使用硫酸铵时
通常有两种方法
加入饱和硫酸铵溶液或者
直接加入固体硫酸铵
如何配制饱和硫酸铵溶液呢
取固体硫酸铵800克
加去离子水1000 mL
不断搅拌条件下加热至50~60℃
保持30分钟
趁热过滤
滤液在室温中过夜有结晶
析出即达到100%饱和度
如果加入固体硫酸铵
可以直接查阅硫酸铵溶液饱和度计算表
简单计算固体硫酸铵的加入量
注意硫酸铵溶液饱和度计算
表有0℃和25℃两种
查阅时一定要看清楚温度
根据自己的实验条件
依据合适的
计算表进行计算
下面请计算室温下固体硫酸铵的加入量
如果现有100mL蛋白提取液
我想得到50%饱和度的硫酸铵溶液
需要加入多少固体硫酸铵呢
请看表格
第三行显示的是每100mL
溶液加入固体硫酸铵的量
第4行50%饱和度那列
的数字是31.3
表格中数字表示的是从不含
硫酸铵的溶液到加入硫酸铵
达到50%饱和度溶液时
需要加入
固体硫酸铵的克数
请注意
65%饱和度的数据是43克
下面
请计算
如果现有185mL蛋白粗提液
我想得到65%饱和度的硫酸铵溶液
需要加入多少固体硫酸铵呢
如公式所示
明白了这些计算后
让我们再看看下面的问题
如图所示
烧杯中有A、B、C三种蛋白质
假如A蛋白是目标蛋白
在20%饱和度硫酸铵
溶液中溶解性最小
而B和C分别在50%和80%饱和度
硫酸铵溶液中溶解性最小
如何获得A蛋白呢
是不是直接加硫酸铵到20%饱和度
离心弃去上清液
沉淀就是目标蛋白A
对
就是如此获得目标蛋白A
如果A蛋白不是目标蛋白
而B蛋白是
如何获得B蛋白呢
直接加硫酸铵到20%饱和度
离心弃去杂蛋白沉淀
在上清液中再加入硫酸铵
达到50%饱和度
离心沉淀中就有大量的目标蛋白B
那么加入多少克固体硫酸铵
才能将蛋白质溶液从20%饱和度
调至50%饱和度硫酸铵溶液
看计算表
横行饱和度20%
那行及第6行竖列饱和度50%
那列
交叉处数值是19g
表示每100mL20%饱和度硫酸铵
溶液中加入19g固体硫酸铵
即可达到50%饱和度
如何加入固体硫酸铵呢
在实际工作中加入硫酸铵
操作有以下注意事项
第一在搅拌条件下
少量
多次
缓慢加入
第二
硫酸加入完毕后
需要静置30分钟以上
离心分离 上清液和沉淀
为什么要如此操作呢
请你们考虑一下
在搅拌条件下缓慢加入
目的是避免快速加入
造成溶液局部盐浓度过高
致使某些高饱和度硫酸铵
溶液才能沉淀下来的
蛋白质发生沉淀
影响分离效果
硫酸铵加入完毕后
需要静置30分钟以上
离心分离 上清液和沉淀
该步骤操作的目的是让该饱和度
下沉淀的蛋白质充分沉淀
在现实生活中常用到盐析方法
例如
重组人生长素的分离
纯化及结构确定
这篇文献就涉及到盐析方法
如图所示
在前期纯化获得的低渗溶液中
加入固体硫酸铵溶液达到45%饱和度
搅拌均匀后放置在2~8℃条件下
静置盐析两小时
8000G离心
30分钟收集沉淀
经缓冲液溶解回收8000G
再离心30分钟收集上清液
该溶液极为盐析沉淀回收溶液
这步沉淀是为了获得目标蛋白
之前我们也谈到过盐析
去除杂蛋白的方式
这里不再举例
以上是本视频的主要内容
下面我将对本部分内容进行小结
在这个视频中
我首先讲解了硫酸铵作为
中性盐的优越性能
介绍了获得不同饱和度硫酸铵溶液
固体硫酸铵加入量的计算
最后指出了硫酸铵加入的注意事项
谢谢大家参与!
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