当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第六章 利用电泳对生物大分子进行检测 > 第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳 > 核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析
经过琼脂糖凝胶电泳分离的DNA,我们肉眼看不到条带的位置,需要通过染色法检测和观察,分析样品的大小和纯度。可以采用凝胶内染色(胶染法)或电泳后染色(泡染法)观察。凝胶内染色是在电泳前制备凝胶时将染料按一定比例加入,电泳后染色是在电泳结束后,将凝胶浸泡在含有染料的溶液中染色。这张表中总结了两种方法的优点和缺点。凝胶内染色更方便,染料用量少。但是,因为带正电的染料与核酸的迁移方向相反,会影响低分子量样品的检测,特别是在长时间运行的情况下。此外,与核酸结合的染料会改变样品的迁移率,导致检测到样品的大小与实际大小有差别。电泳后染色不影响样品的检测,是准确测定样品大小的首选方法。但是,电泳后染色所需时间较长,染色液用量大,会产生更多的有害废物。
了解了染色方法,现在我们来认识几种常见的核酸染料。有的是非荧光染料,有的是荧光染料。非荧光类染料是与DNA通过离子键结合来显示DNA的位置的。非荧光染料的灵敏度不如荧光类染料,但是非荧光类染料不需要紫外光激发,能够减少对DNA的破坏。常见的非荧光染料有噻嗪类染料,比如亚甲基蓝。除此以外,还有尼罗蓝类染料。荧光染料与DNA结合后,可在某一波长的紫外光照射下观察,灵敏度比较高。荧光染料和非荧光染料各有优劣,我们可以根据实验目的和实验条件进行选择。目前,实验室琼脂糖凝胶电泳结果的观察中常用的是核酸的荧光染料,荧光染料有很多种类,这里我们以溴化乙锭和新型荧光染料Gel-red为例进行介绍。
实验室最常用、最便宜的DNA染色液是溴化乙锭,简称为EB,这是溴化乙啶的结构式。溴化乙啶中的乙锭基团可以嵌入到DNA分子的碱基对之间,形成荧光络合物,紫外光照射后DNA所在处发出橙黄色的光,因此我们可以观察到DNA的条带。溴化乙啶可以在电泳前制备琼脂糖凝胶的过程中加入。通常将溴化乙啶配成10 mg/mL的储存液浓度,加入凝胶中的推荐浓度为0.5 μg/mL,或者是在电泳结束后将凝胶放入含有0.5 μg/mL 溴化乙啶的水或缓冲液中染色30至45 min。溴化乙啶可以检测到少至10 ng 的DNA。需要注意的是,溴化乙啶是潜在的可致癌诱变剂,同学们在使用时一定要注意防护,避免直接接触皮肤。
为了更安全、高效地检测核酸条带,陆续开发出很多新型的荧光染料,Gel-red就是其中的一种。这是它的结构式。Gel-red有很好的稳定性、灵敏度和安全性。它的挥发性低,分子极性不强,难以穿透进入到细胞膜内。但是GelRed并不是完全没有毒性,同学们使用时还是要注意防护,小心操作。
通过核酸的琼脂糖凝胶电泳和染色,我们就可以分离并观察到分子量大小不同的DNA片段。如何确定待测DNA片段的大小呢?对于线性双链DNA片段来说,在一定范围内,DNA的迁移距离与分子量的对数成反比。我们可以在电泳时,将一系列分子量已知的核酸样品,即分子量标准,与待测样品在同一块胶上进行电泳,比较分子量标准与待测样品的迁移距离,从而可以推断待测样品的分子量大小。
下面以这张实际的电泳图谱为例分析,最左侧这列是分子量标准,它的各条条带的大小如图中所示,待测样品是PCR的产物,预计大小是170 bp,电泳后条带的位置位于200 bp和100 bp之间,更接近200 bp,因此可以初步判断这是我们的目的条带,后续可以通过测序等方法进行进一步的鉴定。此外,因为分子量标准每一条带的含量是已知的,通过比较待测样品条带亮度与分子量标准条带的亮度,还可以判断样品中DNA的浓度。
本节课,我们了解了琼脂糖凝胶电泳的荧光染料溴化乙啶以及新型核酸染料Gel-red的染色原理和特点,同时也学习了核酸琼脂糖凝胶电泳后的结果分析的方法。同学们在实验过程中选择了什么核酸染料呢?有没有遇到什么问题呢?可以在讨论区和我们展开讨论。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试







