当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第一节 蛋白质的定量测定 > 双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算
我们按照实验指导的步骤
制作标准曲线
并和未知浓度样品一起与
双缩脲试剂发生反应后
就得到了540纳米
下的一系列吸光度值
首先绘制标准曲线
这里有个问题
我们在配制好标准曲线后
蛋白质溶液体积是1毫升
而加入双缩脲试剂后
总体积变成5毫升
那么我们在计算蛋白质浓度的体系
应该是按1毫升算
还是按5毫升算
两种体系下计算出的标准曲线
蛋白质浓度显然是不同的
你会如何选择呢
请注意
标准曲线法测定和计算
未知样品浓度的时候
主要是让未知样品的吸光度值和
标准曲线的吸光度值进行比较
然后按比例计算出未知样品的浓度
所以我们需要知道的
是样品的吸光度
落在标准曲线的什么位置
那么样品吸光度在标准曲线的
位置是什么时候确定的呢
其实在我们配置好标准曲线和
样品加入双缩脲试剂之前
浓度就已经确定
样品的浓度在标准曲线的什么
位置也已经固定
后面加入等体积的反应试剂
只会使所有管的浓度按比例变化
并不会影响未知浓度样品
落在标准曲线的位置
同样也不会影响未知样品浓度的计算
所以说对于需要发生反应
生成有颜色产物
再进行测定的实验来说
都是以最初配置的标准
曲线浓度为横坐标
以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线
而与加入反应试剂的体积没有关系
在本次双缩脲法测定蛋白质
浓度的实验中
我们以一毫升标准曲线
的浓度为横坐标
以每管的吸光度为纵坐标
绘制标准曲线
请注意完整的标准曲线需要有图名
横纵坐标的说明
单位波长等信息方便别人查看
然后将未知样品多个平行样
的吸光度值取平均值
根据拟合方程计算出未知样品的浓度
X=(0.469-0.0025)÷0.0733
就等于
6.364毫克每毫升
如果前期样品有稀释的话
需要计算稀释倍数
将6.364乘以稀释倍数
就可以得到原始样品中的蛋白质浓度
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