当前课程知识点:基础生物化学实验 >  第三章 物质的定量测定 >  第一节 蛋白质的定量测定 >  Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频课程列表

Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法在线视频

下一节:Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

返回《基础生物化学实验》慕课在线视频列表

Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法课程教案、知识点、字幕

我们前面已经学过了三种

蛋白质浓度的测定方法

回想一下

你还记得是哪三种吗

对了 就是紫外法

双缩脲法和lowry法也就是Folin酚法

其中紫外法的干扰比较多

双缩脲法的灵敏度很低

Folin酚法灵敏度很高

但需要将近一个小时的时间

今天我们来学习第4种蛋白质

浓度测定的方法

Bradford法

这是一种又灵敏又快速的方法

下面我们就一起来看看

这种方法是怎么回事

这个方法是Marion M. Bradford在1976年

建立并发表的

其主要试剂是考马斯亮蓝G-250

这样一种有机染料

所以这个方法常被称为

Bradford法

或者是考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝G-250染料有三种形式

阴离子呈现蓝色

中性为绿色

而阳离子为红色

在酸性条件下

染料可以和蛋白质中的精氨酸、赖氨酸

组氨酸

酪氨酸

苯丙氨酸

色胺酸等残基

通过静电相互作用和范德华力相结合

这种结合大约需要两分钟即可完成

结合后燃料从棕色变为蓝色

最大光吸收波长从465纳米

变成595纳米

这个颜色在一个小时内保持稳定

不过在5~20分钟的范围内

颜色的稳定性最好

595纳米处的吸光度值的增加

与染料结合的量成正比

也就是与样品中蛋白质的浓度成正比

所以我们可以通过测定595纳米处

吸光度来计算溶液中蛋白质的浓度

实验室配置考马斯亮蓝

G-250染液很方便

只需要称取100毫克的

考马斯亮蓝G-250

溶于50毫升95%的乙醇中

这个过程可以适当延长时间

确保染料充分溶解

然后加入85%的磷酸100毫升

调节至酸性环境

再用纯水定容到1L

考马斯亮蓝溶液配置好之后

一定要用滤纸过滤

除去不溶的颗粒

避免对测定产生影响

设计标准曲线时

可以使用0.1毫克每毫升

的标准蛋白质溶液

配制一毫升的0~0.1毫克

每毫升的一系列标准蛋白

并将待测样制作三个以上

的一毫升平行样

按照1:5的比例与考马斯亮蓝

G-250染液发生反应

在5~20分钟内测定595

纳米处的吸光度A值

也可以使用一毫克每毫升

的标准蛋白质溶液

配制0.1毫升的0~1毫克

每毫升一系列标准蛋白

并将待测样制作三个以上

0.1毫升的平行样

按照1:50的比例与考马斯亮蓝

G-250染液发生反应

在5~20分钟内测定595

纳米处的吸光度

A值

 Bradford法相比于其他

方法具有以下优点

第一其操作非常便捷

只需要加入一种试剂

在5~20分钟内完成测试即可

第二

此方法的灵敏度高于我们

以前学过的其他方法

最低可以检测到一微克的蛋白质

第三

这种方法的干扰物质比较少

氯化钠 氯化钾 氯化镁

乙醇硫酸铵等试剂均对测定没有影响

不过Bradford法也并非十全十美

首先

碱性物质去垢剂

Tris和EDTA等试剂都会

对测定产生一定影响

需要用对照来扣除

其次

不同种类的蛋白质所含有

的显色氨基酸不同

其吸光度也有所差异

比如牛血清白蛋白的吸光度值几乎

相当于牛丙种球蛋白的两倍

这个方法一般推荐使用牛丙种球蛋白

溶菌酶或者是卵清蛋白作为标准品

因为这几种蛋白质中所含的显色

氨基酸的量和大多数蛋白质比较接近

而牛血清白蛋白则高于一般蛋白质

最后因为考马斯亮蓝G-250染料

本身两种颜色的光谱有一定的重叠

与蛋白结合时会引起背景

颜色光吸收的变化

所以当蛋白质浓度较高的时候

标准曲线会稍有弯曲

不够弯曲的程度很轻

不会影响测定

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--基因工程生产人血清白蛋白之路

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

--蛋白质的盐析提纯

--蛋白质的盐析提纯

--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

--离子交换层析

--亲和层析

--亲和层析

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳的原理

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法笔记与讨论

也许你还感兴趣的课程:

© 柠檬大学-慕课导航 课程版权归原始院校所有,
本网站仅通过互联网进行慕课课程索引,不提供在线课程学习和视频,请同学们点击报名到课程提供网站进行学习。