当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第三章 物质的定量测定 > 第一节 蛋白质的定量测定 > Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法
我们前面已经学过了三种
蛋白质浓度的测定方法
回想一下
你还记得是哪三种吗
对了 就是紫外法
双缩脲法和lowry法也就是Folin酚法
其中紫外法的干扰比较多
双缩脲法的灵敏度很低
Folin酚法灵敏度很高
但需要将近一个小时的时间
今天我们来学习第4种蛋白质
浓度测定的方法
Bradford法
这是一种又灵敏又快速的方法
下面我们就一起来看看
这种方法是怎么回事
这个方法是Marion M. Bradford在1976年
建立并发表的
其主要试剂是考马斯亮蓝G-250
这样一种有机染料
所以这个方法常被称为
Bradford法
或者是考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝G-250染料有三种形式
阴离子呈现蓝色
中性为绿色
而阳离子为红色
在酸性条件下
染料可以和蛋白质中的精氨酸、赖氨酸
组氨酸
酪氨酸
苯丙氨酸
色胺酸等残基
通过静电相互作用和范德华力相结合
这种结合大约需要两分钟即可完成
结合后燃料从棕色变为蓝色
最大光吸收波长从465纳米
变成595纳米
这个颜色在一个小时内保持稳定
不过在5~20分钟的范围内
颜色的稳定性最好
595纳米处的吸光度值的增加
与染料结合的量成正比
也就是与样品中蛋白质的浓度成正比
所以我们可以通过测定595纳米处
吸光度来计算溶液中蛋白质的浓度
实验室配置考马斯亮蓝
G-250染液很方便
只需要称取100毫克的
考马斯亮蓝G-250
溶于50毫升95%的乙醇中
这个过程可以适当延长时间
确保染料充分溶解
然后加入85%的磷酸100毫升
调节至酸性环境
再用纯水定容到1L
考马斯亮蓝溶液配置好之后
一定要用滤纸过滤
除去不溶的颗粒
避免对测定产生影响
设计标准曲线时
可以使用0.1毫克每毫升
的标准蛋白质溶液
配制一毫升的0~0.1毫克
每毫升的一系列标准蛋白
并将待测样制作三个以上
的一毫升平行样
按照1:5的比例与考马斯亮蓝
G-250染液发生反应
在5~20分钟内测定595
纳米处的吸光度A值
也可以使用一毫克每毫升
的标准蛋白质溶液
配制0.1毫升的0~1毫克
每毫升一系列标准蛋白
并将待测样制作三个以上
0.1毫升的平行样
按照1:50的比例与考马斯亮蓝
G-250染液发生反应
在5~20分钟内测定595
纳米处的吸光度
A值
Bradford法相比于其他
方法具有以下优点
第一其操作非常便捷
只需要加入一种试剂
在5~20分钟内完成测试即可
第二
此方法的灵敏度高于我们
以前学过的其他方法
最低可以检测到一微克的蛋白质
第三
这种方法的干扰物质比较少
氯化钠 氯化钾 氯化镁
乙醇硫酸铵等试剂均对测定没有影响
不过Bradford法也并非十全十美
首先
碱性物质去垢剂
Tris和EDTA等试剂都会
对测定产生一定影响
需要用对照来扣除
其次
不同种类的蛋白质所含有
的显色氨基酸不同
其吸光度也有所差异
比如牛血清白蛋白的吸光度值几乎
相当于牛丙种球蛋白的两倍
这个方法一般推荐使用牛丙种球蛋白
溶菌酶或者是卵清蛋白作为标准品
因为这几种蛋白质中所含的显色
氨基酸的量和大多数蛋白质比较接近
而牛血清白蛋白则高于一般蛋白质
最后因为考马斯亮蓝G-250染料
本身两种颜色的光谱有一定的重叠
与蛋白结合时会引起背景
颜色光吸收的变化
所以当蛋白质浓度较高的时候
标准曲线会稍有弯曲
不够弯曲的程度很轻
不会影响测定
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-第二节 移液器的操作要点
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