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荧光分光光度计的设计原理和使用规范

荧光,是指分析物分子的价电子吸收光子能量后跃迁至激发态,并跃迁回到基态所引起的光发射过程。分析物的吸收光通常在紫外区或可见区,而发射的荧光一般在可见光区。

对于低浓度的荧光物质,当实验条件一定时,其荧光发射强度与荧光物质的浓度成正比。根据此比例关系,我们可以测定未知样品的荧光强度值,并与标准品的荧光强度值进行比较,从而计算出未知样品的浓度。

具体来说,常用测定计算方法有两种:

第一种是常用的标准曲线法:具体操作是配制一系列已知浓度的标准品,与待测液经过相同条件测定后,绘制标准曲线,以此获得待测物浓度。

第二种是相对简化的对照品比较法:此方法不配制标准曲线,而是取已知浓度对照品和待测样品,用相同空白溶液校正后,分别测定二者荧光强度值,以此获得待测物浓度

可用于荧光定量的物质,如果本身就具有荧光,可以采用直接测定法,直接测定荧光信号
而本身不具有荧光的物质,也可以采用间接测定法进行测定,间接测定法也分为两种:

一种是荧光衍生化:也就是将不具有荧光的物质,通过化学反应、光化学反应及电化学反应,使待测物等比例转化为具有荧光的衍生物,从而测定荧光,通过前述测定方法计算其浓度;
还有一种称为荧光淬灭法:这种方法是让不具有荧光的物质,通过能量转移、化学反应等方式,淬灭掉其他荧光化合物的荧光,测定荧光强度值,计算出淬灭程度与待测物浓度的关系,进而计算出待测物浓度。

无论哪种方法,都需要用到荧光分光光度计来测定荧光强度,所以我们接下来就学习一下荧光分光光度计的基本使用,以”棱光”牌F95S荧光分光光度计为例。

在学习仪器操作前,我们先来了解一下荧光分光光度计的基本构造:

荧光分光光度计一般包括光源、单色器,样品池和检测器4部分,目前大部分荧光分光光度计都采用高压氙灯作为光源,外套是石英,内充氙气。

荧光分光光度计内部一般都需要两个单色器:激发光单色器和发射光单色器,一般采用光电倍增管作为检测器。

因为荧光分光光度计的发射光检测装置要与激发光垂直,避免受到激发光干扰,所以需要使用四面透光的比色杯,如果激发光在紫外区,则需要使用四面透光的石英比色杯。

F95S荧光分光光度计的激发光光源是固定波长的,所以开机前请先确认安装了所需波长的激发光光源。打开机器左侧面的开关,预热半小时,我们主要的操作都集中在面板上。

接下来,调节波长至待测物的发射光波长,调试仪器需要用到空白管和样品管,其中空白管中含有除了待测物之外的溶剂和试剂,样品管则使用本次测定最大浓度的样品。

先将样品管放入样品池,因为比色杯4面都需要透光,注意轻轻手持比色杯边棱,避免让比色杯壁沾染污渍。

先将样品管放入比色池,关上样品池盖,按一下“归一”键,面板右上角显示1,这是灵敏度,再按归一键,右上角显示2,我们可以看出,不同灵敏度下荧光强度值不同,记住样品管荧光强度在10-100左右的灵敏度,比如本样品在灵敏度2时,样品荧光强度在116左右,我们就可以采用此灵敏度来进行所有样品的测定。

取出样品管,放入空白管,盖上样品池盖,按“调零”键,荧光强度值显示为0,接下来依次放入待测定的所有样品并记录荧光强度值即可。

实验结束,关闭仪器电源。

 

 


下一节:离心机的设计原理和使用规范

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基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

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-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

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--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

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--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

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--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

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--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

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--IMAC亲和层析

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--IMAC亲和层析技术的基本步骤

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

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--质粒DNA的提取制备

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--拟南芥叶片基因组DNA提取

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--紫外分光光度法测定核酸

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

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--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

荧光分光光度计的设计原理和使用规范笔记与讨论

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