当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第二章 生命科学三大必备仪器的使用 > 第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范 > 荧光分光光度计的设计原理和使用规范
荧光,是指分析物分子的价电子吸收光子能量后跃迁至激发态,并跃迁回到基态所引起的光发射过程。分析物的吸收光通常在紫外区或可见区,而发射的荧光一般在可见光区。
对于低浓度的荧光物质,当实验条件一定时,其荧光发射强度与荧光物质的浓度成正比。根据此比例关系,我们可以测定未知样品的荧光强度值,并与标准品的荧光强度值进行比较,从而计算出未知样品的浓度。
具体来说,常用测定计算方法有两种:
第一种是常用的标准曲线法:具体操作是配制一系列已知浓度的标准品,与待测液经过相同条件测定后,绘制标准曲线,以此获得待测物浓度。
第二种是相对简化的对照品比较法:此方法不配制标准曲线,而是取已知浓度对照品和待测样品,用相同空白溶液校正后,分别测定二者荧光强度值,以此获得待测物浓度
可用于荧光定量的物质,如果本身就具有荧光,可以采用直接测定法,直接测定荧光信号
而本身不具有荧光的物质,也可以采用间接测定法进行测定,间接测定法也分为两种:
一种是荧光衍生化:也就是将不具有荧光的物质,通过化学反应、光化学反应及电化学反应,使待测物等比例转化为具有荧光的衍生物,从而测定荧光,通过前述测定方法计算其浓度;
还有一种称为荧光淬灭法:这种方法是让不具有荧光的物质,通过能量转移、化学反应等方式,淬灭掉其他荧光化合物的荧光,测定荧光强度值,计算出淬灭程度与待测物浓度的关系,进而计算出待测物浓度。
无论哪种方法,都需要用到荧光分光光度计来测定荧光强度,所以我们接下来就学习一下荧光分光光度计的基本使用,以”棱光”牌F95S荧光分光光度计为例。
在学习仪器操作前,我们先来了解一下荧光分光光度计的基本构造:
荧光分光光度计一般包括光源、单色器,样品池和检测器4部分,目前大部分荧光分光光度计都采用高压氙灯作为光源,外套是石英,内充氙气。
荧光分光光度计内部一般都需要两个单色器:激发光单色器和发射光单色器,一般采用光电倍增管作为检测器。
因为荧光分光光度计的发射光检测装置要与激发光垂直,避免受到激发光干扰,所以需要使用四面透光的比色杯,如果激发光在紫外区,则需要使用四面透光的石英比色杯。
F95S荧光分光光度计的激发光光源是固定波长的,所以开机前请先确认安装了所需波长的激发光光源。打开机器左侧面的开关,预热半小时,我们主要的操作都集中在面板上。
接下来,调节波长至待测物的发射光波长,调试仪器需要用到空白管和样品管,其中空白管中含有除了待测物之外的溶剂和试剂,样品管则使用本次测定最大浓度的样品。
先将样品管放入样品池,因为比色杯4面都需要透光,注意轻轻手持比色杯边棱,避免让比色杯壁沾染污渍。
先将样品管放入比色池,关上样品池盖,按一下“归一”键,面板右上角显示1,这是灵敏度,再按归一键,右上角显示2,我们可以看出,不同灵敏度下荧光强度值不同,记住样品管荧光强度在10-100左右的灵敏度,比如本样品在灵敏度2时,样品荧光强度在116左右,我们就可以采用此灵敏度来进行所有样品的测定。
取出样品管,放入空白管,盖上样品池盖,按“调零”键,荧光强度值显示为0,接下来依次放入待测定的所有样品并记录荧光强度值即可。
实验结束,关闭仪器电源。
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试




