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紫外法测定蛋白质浓度的操作方法


我们在上一节中学过了紫外法测定蛋白质浓度的实验原理，接下来，我们一起来看看利用标准曲线法测蛋白紫外吸收进而计算蛋白质溶液浓度的实验设计、操作和注意事项。

首先，当你要建立一个标准曲线法测物质浓度的实验时，第一要考虑的是此方法的测定浓度范围，只有在此范围内测定吸光度和浓度才呈线性关系。紫外法的测定浓度范围是0.1-1.0mg/ml之间，所以我们的标准曲线就定在此范围内，让不同浓度的蛋白质标准液平均分布在此范围中。

除了考虑测定浓度范围以外，我们还需要考虑实验体系大小，使用不同的仪器设备和比色杯，需要的最低测定体积不同，设计实验体系前要确定用什么比色杯，需要多少液体才够测定，还要留出润洗比色杯的液体体积。我们学生实验中常用的都是1cm光径的比色杯，常用的分光光度计光路高度一般在比色杯高度的一半的位置，要保证液体盖过光路，至少需要3ml液体。

所以常用的实验体系一般设计为4-5ml，在此体系范围内让6-10个标准蛋白管尽量做到浓度均匀分配。这两条是我们在设计标准曲线时主要考虑的因素，现在你都知道了，建议你把视频暂停，自己尝试设计一下标准曲线各管的浓度和加样量，然后再跟我们接下来要公布的对照一下，看看自己设计的是否合理。

这里给大家提供两套操作体系方案，都符合实验设计原则，和你设计的一样吗？

图片2.png

大家可以发现，我们用来配制标准曲线的标准蛋白溶液的浓度，与标准曲线中最高浓度的管是一致的，这样操作的好处是每一管的加样量不会太少，尽量减少同学们由于对移液器操作不熟练导致加液量差异带来的误差。如果你已经操作很熟练，可以根据自己的需要和习惯采用更高浓度的标准蛋白溶液。
你现在就可以试试，用1%的标准蛋白溶液如何配制紫外法的标准曲线各管呢？欢迎在论坛讨论。

确定了标准曲线各管的浓度和加样体积，接下来要确定的是样品的加入量。前面我们学习比色分析法的时候已经知道，样品的浓度一定要在标准曲线中间1/3，才可以尽量减低误差，所以测定前应通过查阅资料或预实验来确定待测溶液的浓度范围，将溶液稀释到浓度在标准曲线1/3的范围内，然后和标准曲线一起测定，测定后再根据稀释倍数，计算待测溶液的蛋白质浓度。

比如我们这个实验选用8个点的标准曲线，预实验结果应将待测液稀释4倍，为了减少误差，我们做3个待测液的平行样，所以最终的加样计划就是这样：


5.png 

确定了加样体积，我们就可以开始做实验了。

还记得在分光光度计使用一节我们学过仪器必须先预热20-30分钟吗？建议你估计好自己的操作时间，在开始测定前20-30分钟打开仪器和氘灯预热。将试管做好标记，依次加入设计体积的水，我们在配制标准曲线时一般先加入水，这样不会对后续操作造成污染，若先加蛋白质溶液，那后期加水就要很小心避免污染移液器和吸头。加入相同液体不用更换吸头，因为蛋白质也是水溶液，水不会对其造成污染，所以加完水再加蛋白质的时候也可以不用更换吸头，如果考虑到吸头内部可能吸附水分，则更换新吸头，并预润湿2-3次后，吸取蛋白质溶液依次加入各管。吸取待测蛋白溶液前务必更换新吸头，因为这和标准蛋白质溶液不是相同溶液。

加样结束，待分光光度计预热够时间，并确认波长已设定为280nm就开始测定。使用的石英比色杯干净且干燥时，不用润洗，直接倒适量液体进比色杯即可。首先将标准曲线管1加入相当于比色杯2/3~3/4高度的液体，放入分光光度计，这是标准曲线的空白管，在整个测定过程中都不再取出，用于每次校正仪器的透光率100%。然后依次将管2、3倒入适量液体，放入分光光度计，本仪器采用挡光块帮助调节透光率0%，所以请把挡光块也放好，盖上比色池盖，拉动样品池拉杆，将挡光块置于光路的时候按0%，调透光率为0，再将空白管置于光路上，按100%按钮调透光率为100%，然后将档位调节到吸光度A档，此时数值应该显示为0，拉动拉杆，让标准曲线的第2管和第3管依次置于光路，读取并记录吸光度A值。

本轮测定结束，将档位调回透光率T档，打开样品池盖，将空白管和挡光块保持不动，取出剩余两只比色杯，倒掉溶液，按照我们之前讲过的润洗方法分别用标准曲线4、5管溶液润洗后加入适量液体，检查比色杯外壁洁净，放入样品池，盖上样品池盖，检查和调节透光率0%和100%没有问题，调到吸光度A档，拉动样品池杆，将标准曲线4、5管置于光路，记录数据，调回透光率档，取出标准曲线4、5管的比色杯。

接下来要测的有标准曲线第6管和样品管，注意，标准曲线第6管的浓度是高于标准曲线4、5管的，所以我们和前一步操作一样，直接润洗即可。
而样品管的浓度应该不会高于标准曲线4、5管，所以我们需要先用水将比色杯彻底清洗，尽量去除杯内残余水分，然后用样品液按润洗步骤将比色杯润洗2-3遍后，再将样品液加入比色杯，按照仪器操作步骤进行测定和记录。

本轮测定完成后，按操作规范取出两只比色杯，用水彻底清洗后，分别用剩余的样品溶液润洗2-3遍后，按步骤测定吸光度值，并记录。

实验全部结束后，关闭分光光度计，取出所有比色杯，用纯水反复冲洗干净，倒扣在滤纸上晾干。


下一节:紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

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第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么？

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-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习？

--不同需求的同学如何学习本课程？

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-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

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-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

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--正向移液和反向移液

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--移液器的日常校准

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--移液器的操作中易错点

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--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

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--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

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--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

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--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

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-第三章 物质的定量测定 作业

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-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗？

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

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-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作（Folin酚法）

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-第三节 酶米氏常数的测定

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--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

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--菠萝蛋白酶米氏常数的计算（Folin酚法）

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-第四章 酶活力的测定 作业

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-查阅一个你感兴趣的酶，想想怎么测？

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

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--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

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--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子，如何纯化呢？

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

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--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

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--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

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--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳，还有什么用于生物大分子鉴定的方法？

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

紫外法测定蛋白质浓度的操作方法笔记与讨论

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